一种牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因及其编码蛋白和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种脐形紫菜栊牛儿基栊牛儿基二磷酸 合酶PuGGPS蛋白及其编码基因在紫菜类胡萝卜素和叶绿素代谢中的应用。
【背景技术】
[0002] 紫菜是一种重要的大型经济海藻，是中国、日本和韩国主要的栽培红藻之一。全世 界的紫菜栽培产业年产值约13亿美元（Blouin et al. 2011)。紫菜不仅具有重要的经济 价值，而且是研究植物生理、生化以及早期进化的理想材料（Waaland et al. 2004; Lin et al. 2009; Su et al. 2010)。紫菜生长在潮间带，必须耐受周期性的极端逆境（如高光、 高盐、失水等），长期的进化过程使其产生了在逆境下对光合系统的保护机制。
[0003] 类胡萝卜素在高等植物中起着吸收光能和光保护双重作用。高等植物中类胡萝卜 素通常整合在捕光色素复合物或者光系统的反应中心，不仅在结构上起着稳定光系统的作 用（Dali'Osto et al. 2006)，辅助叶绿素吸收光能，并且可以通过叶黄素循环机制将吸 收的多余光能以热能的形式放散到空气中从而保护光系统不受光氧化损伤（Niyogi 1999; 唐婷等2012) (Ruban et al. 2007)。虽然研究表明，红藻大多数物种都不具有叶黄素循 环所需要的花药黄素和堇菜黄素（Schuber et al. 2006)，但有工作表明，红藻等以藻胆体 进行光合作用的原始藻类中，仍然主要通过类胡萝卜素结合的蛋白与藻胆体核心相互作用 淬灭多余光能来保护光合系统（Kirilovsky, 2007; Rakhimberdieva et al.，2007)。不 仅如此，类胡萝卜素在植物体内通常积累在花、果实和根部，鲜艳的颜色可以吸引昆虫或动 物作为传粉或者散播种子的媒介。此外，类胡萝卜素作为维生素A的前体，对人类和动物有 很大的营养价值（Cuningham and Gantt 1998 ; Shumskaya and Wurtzel 2013)。而类胡 萝卜素中的叶黄素和玉米黄素存在于人类和动物眼中的黄斑区域，对人类视觉感受光线变 化有十分重要的作用（Handelman et al. 1998)。
[0004] 栊牛儿基栊牛儿基二磷酸（GGPP)是由栊牛儿基栊牛儿基二磷酸合酶（GGPS)催 化产生的，是植物中十分重要的代谢中间产物，是类胡萝卜素、叶绿素、维生素E (生育酚)、 维生素A、赤霉素、脱落酸、栊牛儿基栊牛儿基化蛋白等重要的生理生化物质合成代谢的前 体物（Okada et al. 2000)，并且可通过萜类合酶合成各种单萜、倍半萜和二萜等生理活性 物质。对于可食用的植物如紫菜来说，可挥发的萜类物质可影响其口感和风味(伊纪峰等 2009)。研究表明，拟南芥中GGPS是由小基因家族编码，共有12个，Okada et al. (2000) 的研究表明只有GGPS11和GGPS7定位于质体中，并负责类胡萝卜素和叶绿素的合成代谢。 有工作表明，不同的GGPS在植物中可能负责不同的GGPP代谢库。然而，在已形成沿海经济 支柱产业的紫菜物种中，尚未有任何关于GGPS的报道。对以脐形紫菜为代表的紫菜物种中 GGPS的发现和功能鉴定有利于未来利用基因工程技术提高紫菜中类胡萝卜素等营养成分 的含量来提高紫菜的营养价值，并且通过提高萜类物质的含量改善紫菜的口感和风味，从 而整体上提高紫菜的经济价值。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种栊牛儿基栊牛儿基二磷酸合酶基因及其编码蛋白和应用，该基 因转录组编码栊牛儿基栊牛儿基二磷酸合酶，从而使紫菜中能够合成并积累类胡萝卜素。
[0006] 本发明的一种栊牛儿基栊牛儿基二磷酸合酶基因，它的核苷酸序列如序列表Seq ID No :1 所示。
[0007] 本发明的一种栊牛儿基栊牛儿基二磷酸合酶基因，它的核苷酸序列为与序列表 SEQ ID NO: 1核苷酸序列具有80%以上同源性且编码相同功能蛋白质的多核苷酸序列。
[0008] 本发明的一种栊牛儿基栊牛儿基二磷酸合酶基因编码的蛋白，它的氨基酸序列如 序列表Seq ID No :2所示。
[0009] 本发明的一种栊牛儿基栊牛儿基二磷酸合酶基因编码的蛋白，它的氨基酸序列为 由序列表Seq ID No :2所述的氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或者 添加且具有与序列表Seq ID No :2所述的氨基酸残基序列相同活性的氨基酸序列。
[0010] 本发明的栊牛儿基栊牛儿基二磷酸合酶基因来源于脐形紫菜紅ra umbi1icalis\名爾、为PuGGPS，V丄飞该基浪愤爾、％PuGGPS。
[0011] 所述的栊牛儿基栊牛儿基二磷酸合酶来源脐形紫菜。
[0012] 一种重组表达载体，它包括权利要求1或2所述的基因。
[0013] 一种转化子，它包括含有权利要求6所述的重组表达载体的宿主细胞。
[0014] 所述的一种转化子，它的宿主为微生物、植物或转基因细胞系。
[0015] 本发明的一种栊牛儿基栊牛儿基二磷酸合酶基因的应用，它用于紫菜类胡萝卜素 代谢基因工程中。
[0016] 本发明的栊牛儿基栊牛儿基二磷酸合酶基因获取方式为： 一、 总RNA的提取 选取脐形紫菜(由缅因大学Susan Brawley教授赠予）采用 RNAiso试剂（Takara公司）并用8 mol/L的LiCl沉淀提取纯化脐形紫菜总RNA，经电泳检 测和紫外分光光度计检测确认RNA的完整性、纯度以及浓度后，于-80 ° C保存； 二、 脐形紫菜栊牛儿基栊牛儿基二磷酸合酶（PuGGPS)基因的克隆 以不同生物中的栊牛儿基栊牛儿基二磷酸合酶作为查询序列，在脐形紫菜转录组数 据库中搜索到一条可能编码栊牛儿基栊牛儿基二磷酸合酶的转录本（P_umbilicalis_ esContig5139)。根据该转录本，设计引物，扩增PuGGPS 0RF全长： 3' - PCR 引物：TCAGTTCCTTCGCTCAAATGATGAAG 5' - PCR 引物：ATGCTCCGCACCGAGCCC 用1 yg步骤一获得的总RNA作为反转录的模板，经反转录合成cDNA第一链后，进行 PCR扩增，PCR反应体系中加入终浓度为5%的DMS0，PCR程序如下：98°C预变性15 sec ;98°C 变性 10 sec，64°C退火 10 sec，72°C延伸 2 min，35 个循环后，72°C 5 min。
[0017] 将PCR产物连接至pMD19-T (Takara公司)载体，测序后获得具有完整编码区的脐 形紫菜栊牛儿基栊牛儿基二磷酸合酶基因序列Seq IDNo:1。
[0018] 三、大肠杆菌表达载体的构建 用带有fee I和沒i/?d III酶切位点的引物扩增完整编码区或者截除信号肽后 部分序列克隆至pET-32b载体。
[0019] 带有fee I和"i/?d III酶切位点的引物序列如下： 上游引物：GTACGAGCTCCATGCTCCGCACCGAGC 或：GTACGAGCTCCACCCAAAAAGACAGCGTGG 下游引物：CCCAAGCTTGGGTCAGITCCTTCGCTCA 四、酶活鉴定 将步骤三获得的表达载体pET-PuGGPS与携带有一系列噬夏孢欧文氏菌类胡萝卜素合 成相关基因CrtB (PSY)、CrtI (H)S/ZDS)和CrtY (LCYB)的载体pAC-94N共转入大肠杆 菌。载体PAC-94N上携带的基因在有活性GGPS的情况下，可以大肠杆菌的细胞积累胡 萝卜素，从而使大肠杆菌菌落或菌液呈橙黄色；若没有活性GGPS，大肠杆菌仍为白色。空 载体pET-32b与pAC-94N共转作为负对照，已知功能烟草栊牛儿基栊牛儿基二磷酸合酶与 PAC-94N共转作为正对照。HPLC分析各个样品的产物。
[0020] 本发明提供的脐形紫菜基因功能是，其能够参与 植物的类胡萝卜素代谢，在除草剂达草灭的处理下，脐形紫菜叶状体基因表达发生 变化。
[0021] 本发明的A/6KP5基因来源于脐形紫菜，其基因工程受体植物适用于水稻等生物。
[0022] 利用本法发明的A/6KP5基因作为目的基因构建植物表达载体，可以利用花椰菜 花叶病毒CAMV35S启动子、乙醇诱导启动子等，必要时可以包括增强子。为了简化转化植株 的鉴定，可使用选择性标记(如抗生素酶)。所用的表达载体可使用Ti质粒、Ri质粒以及植 物病毒载体等。转化方法可用农杆菌介导法或其他方法转化植物。
[0023] 本发明首次发现紫菜属物种里参与类胡萝卜素合成代谢途径里的一个酶即栊牛 儿基栊牛儿基二磷酸合酶，并证实该酶参与紫菜中类胡萝卜素和萜类物质的代谢。
[0024] 本发明获得编码该酶的基因序列，为利用基因工程技术改进紫菜里类胡萝卜素或 者萜类物质代谢途径，以提高紫菜里类胡萝卜素和萜类物质的含量提供了基础。
[0025] 通过本发明提供的PuGGPS基因和蛋白，对紫菜属物种