本发明属于益生菌制剂领域，具体涉及一种耐酸、稳定的益生菌微胶囊制剂及其制备方法和应用。
背景技术：
：益生菌包括乳杆菌类、双歧杆菌类和革兰氏阳性球菌类三大类，是一种可以改善人体胃肠道微生物平衡并且对人体健康产生积极影响的活性有益微生物的总称。微生态制剂是利用对宿主有益无害的正常微生物群成员或促进物质制成的制剂。益生菌作为狭义的微生态制剂，具有广泛的市场，主要应用于促进肠道系统健康、抑制肠道致病菌、改善乳糖不耐受症以及改善腹泻等。FHO/WHO对益生菌发挥作用的最低活菌数目要求是定植于肠道中的活菌数目不得少于106-107CFUmL-1(g-1)。目前人体各个部位的菌群平衡都和人体的健康密切相关，常见的菌群失调性疾病主要包括腹泻、乳糖不耐受和便秘等。目前我国临床上使用的益生菌制剂主要包括单菌制剂和复合菌种两种。传统的益生菌产品基于“饥饿存活”的原理，利用冷冻干燥技术降低益生菌中的含水量，使其可以长期存活。但是这类菌种对温湿度和光照等因素非常敏感，使得应用上存在一定的限制。同时，目前国内许多益生菌产品，着重于突出其使用前所含有的活菌数量，避开益生菌经过胃部胃酸影响后的存活率以及定植于肠道发挥作用的活菌数目，同时长期储存稳定性也对益生菌制剂有着很重要的影响。这些因素在一定程度上会影响消费者对益生菌产品实际作用的认识，也会对安全有效益生菌制剂的开发造成一定的影响。为了改善益生菌本身的不耐酸、长期储存稳定性差等缺点，近些年来，大量研究致力于通过微型颗粒或者微型胶囊包裹益生菌活菌，然后通过冷冻干燥或者喷雾干燥来生产相关产品。真空冷冻干燥法是一种最常用于降低益生菌含水量的方法，菌种在真空冷冻干燥后，酶的活性丧失、冻干燥菌粉复水性好、脱水彻底、保存期长、储存运输和使用都很方便，为直投式发酵剂提供良好的基础。但是在冷冻干燥过程中，过低的温度可能会导致细胞内水结晶、细胞失水或者蛋白质失活的情况，导致菌体损伤甚至死亡，会对菌种的生产和保存产生不良影响。因此，在制备益生菌制剂中使用冷冻干燥保护剂，可以在一定程度上保护菌种免受低温的侵害。微囊化技术是一种利用天然或合成的高分子材料作为囊材(壁材)，制备囊膜后将性能不稳定的液体或者固体药物包埋成微胶囊的技术，其内部物质为芯材。使用这种技术可以有效地抵御外界环境对益生菌的影响，有效提高益生菌的活菌数目、耐酸性及存储稳定性。另外，微囊化使用的壁材一般要求都要达到食品级以上。单凝聚法以及复凝聚法是微胶囊常用的制备方法，具有操作简单、条件温和、成本较低以及无毒等优点，但是这些办法制备的微囊粒径常常受限于所采用的喷嘴大小。而如果喷嘴孔径过小，又容易造成制备过程中效率降低的问题。这些因素都会限制微胶囊的使用以及生产，因此在单凝聚法以及复凝聚法的基础上，开发一种可以快速制备微米级粒径、粒径分布均一和可控的微胶囊制备方法对益生菌微胶囊的适用性有着重大的应用和经济学意义。基于挤出法制备的微胶囊的物理本质，可以通过一定外加作用力，使得液滴可分散成更细小的微滴，这些细小的液滴滴入固化剂或者交联剂之后，可以通过物理化学的作用形成微胶囊。而稳定可控的外加作用力则对微胶囊的形态、微胶囊的可控规模化生产以及产品的优良率有着密切关系。当微滴在气体中形成球状的时候，由于液气界面张力较大，可以维持球形，且益生菌不易扩散，微滴滴入固化剂中后可以形成粒径均且有效包埋益生菌的微胶囊。微胶囊造粒仪，可以通过控制菌悬液的泵速使其成为射流，再通过仪器本身的叠加振动，使得喷嘴射出的射流分散成粒径大小相等的液滴，再将液滴滴入固化剂中形成微胶囊。粒径的大小可以通过控制喷嘴以及振动频率来控制。使用微胶囊造粒仪所生产的益生菌微胶囊不仅保持了固化法制备简单和条件温和等特点，还可以有效降低微胶囊的粒径，生产出的微胶囊粒径均一可控，可以连续化生产，且具有良好的包埋保护效果，具有工业化生产应用的潜力。技术实现要素：基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种益生菌微胶囊及其制备方法和应用，本发明的益生菌微胶囊具有耐酸、稳定的优异性能。为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：一种耐酸、稳定的益生菌微胶囊，包括芯材和壁材，所述壁材为含有天然高分子材料和冻干保护剂的混合溶液，所述益生菌与所述混合溶液的质量比为1:1-1:8；所述混合溶液中天然高分子材料的质量百分比为0.5-7.0％，所述混合溶液中冻干保护剂的质量百分比为5.0-15.0％。在其中一些实施例中，所述益生菌与所述混合溶液的质量比为1:2-1:5。在其中一些实施例中，所述混合溶液中天然高分子材料的质量百分比为1-5％，所述混合溶液中冻干保护剂的质量百分比为5-12％。在其中一些实施例中，所述壁材外还涂覆有包衣材料，所述包衣材料为壳聚糖盐酸盐。在其中一些实施例中，所述益生菌为保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜热链球菌、乳酸乳球菌中的一种或几种；所述冻干保护剂为葡萄糖、海藻糖、可溶性淀粉、甘油、甘露醇、右旋糖酐40和脱脂牛奶中的一种或几种；所述天然高分子材料为胶凝糖、黄原胶、阿拉伯胶、明胶和海藻酸钠中的一种或几种。在其中一些实施例中，所述冻干保护剂为乳糖、海藻糖、甘油和右旋糖酐40中的一种或几种；所述天然高分子材料为阿拉伯胶、明胶和海藻酸钠中的一种或几种。本发明还提供了上述益生菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：1)将经活化增殖培养的益生菌菌液离心，得到益生菌菌泥；2)将步骤1)所述益生菌菌泥加入至含天然高分子材料和冻干保护剂的混合溶液中，混合均匀，得到菌悬液；所述益生菌菌泥与所述混合溶液的质量比为1:1～8；所述冻干保护剂在所述混合溶液中的质量百分比为5-15％；所述天然高分子材料在所述混合溶液中的质量百分比为0.5-7.0％；3)步骤2)的菌悬液在微胶囊造粒仪的供入喷嘴系统中形成微滴，滴入固化剂或交联剂中后，即得到益生菌微胶囊。在其中一些实施例中，还包括对所述益生菌微胶囊进行包衣30-60min的步骤，所述包衣液为体积百分含量为5.0-10.0％的壳聚糖盐酸盐溶液，优选为体积百分含量为6.0-10.0％的壳聚糖盐酸盐溶液。在其中一些实施例中，还包括冷冻干燥的步骤，具体步骤为：将所述益生菌微胶囊放入体积百分比为8.0-18.0％的冻干保护剂溶液中平衡30min后，再在-45℃下预冻3-6h，最后在-40℃下真空冷冻干燥24-40h。在其中一些实施例中，步骤2)中所述益生菌菌泥与所述水溶液的质量比为1:2～5。在其中一些实施例中，步骤3)中所述菌悬液经蠕动泵匀速供入微胶囊造粒仪的供入喷嘴系统中，所述蠕动泵泵速为3～15ml·min-1，供入喷嘴系统的震动频率为600-2500Hz。在其中一些实施例中，所述蠕动泵泵速10ml·min-1，震动频率为1200Hz。在其中一些实施例中，步骤1)中，所述益生菌在MRS肉汤培养基中活化增殖，所述活化条件为35.0-38.0℃，22-26h；所述增殖培养中，接种比例为每100mL培养基中接种2.0-8.0mL菌种；步骤1)中，所述离心条件为0.0-15.0℃，2000-4000r/min离心10-30min。在其中一些实施例中，步骤3)中所述固化液为0.1M-0.3M的CaCl2溶液，所述固化时间为15-45min。本发明还提供了上述益生菌微胶囊在制备保健食品、饮料食品、临床营养制剂、药物微制剂或化妆品中的应用。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1、本发明采用冻干保护剂与天然高分子材料作为壁材，通过控制冻干保护剂与天然高分子材料在混合溶液中的浓度，使得制备得到的益生菌微胶囊制剂具有较好的稳定性和耐酸性；冻干保护剂的浓度过低，则单体积溶液的冻干保护剂分子过少，菌体不能充分的包裹在冻干保护剂分子中，这样会达不到最佳的冻干存活率，浓度过高，其渗透压可能很大，对菌体造成不利的影响，而且，浓度过高也会造成工业成本的提高；而天然高分子材料的浓度过低，则会使得微胶囊在固化过程中成球性差，导致部分益生菌未包埋在微胶囊内部；浓度过高，则天然高分子材料溶液黏度增大，挤出过程可控性低；2、本发明通过调整益生菌菌泥与混合溶液的质量比，使得得到的微胶囊具有很好的性能；益生菌菌泥与混合溶液的比例中，如果混合溶液比例过低，会不足以完全包裹益生菌，使得活菌数偏低；如果比例过高，等量的菌分散在更多量的微胶囊当中，所以测得的每1.0g凝胶珠中益生菌的数量相比于低比例时就会偏低；3、本发明的益生菌微胶囊的处方简单，使用冻干保护剂以及天然高分子材料的混合材料作为本发明的益生菌微胶囊壁材，可以在冷冻干燥过程中对益生菌起到保护作用，既能达到使益生菌休眠的效果，同时又不会使益生菌的活性产生较大的影响，对益生菌的耐酸性和长期储存性有明显的改善，所制备的微胶囊粒径可以根据实验仪器的参数进行调整，粒径可控且分布集中；4、本发明的益生菌微胶囊的制备方法，通过调整喷嘴以及振动频率调整，使得微胶囊粒径均一和相等，微胶囊包埋效果好，可以有效提高益生菌制剂的耐酸性和稳定性，操作简便、工艺参数易控、生产效率高、经济易行，适合工业化规模生产。附图说明图1为实施例1中的益生菌微胶囊经冷冻干燥后，600倍扫描电镜图；图2为实施例2～5中不同保护剂添加比例对嗜热链球菌益生菌微胶囊的冻干存活率的影响；图3为实施例6中冻干菌粉和所制备的微胶囊制剂的储存稳定性对比。A为4℃下冻干菌粉的存活率变化，B为4℃下含有冻干保护剂的存活率变化，C为25℃下冻干菌粉的存活率变化，D为25℃下含有冻干保护剂的存活率变化。具体实施方式下面结合附图和具体实施例进一步叙述本发明，本发明未述及之处适用于现有技术。下面给出本发明的具体实施例，但实施例仅是为了进一步详细叙述本说明，并不限制本发明的权利要求。以下实施例中所使用的试剂或原料，如无特殊说明，均来源于市售。以下实施例中的益生菌微胶囊以益生菌为芯材，益生菌选自保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜酸链球菌、乳酸乳球菌中的一种或几种；优选自长双歧杆菌、短双歧杆菌和嗜酸链球菌中的一种或几种。在本发明中，活菌数采用平板稀释法进行计数。以下实施例中，含有天然高分子材料和冻干保护剂的水溶液所用溶剂为无菌水，且MRS肉汤、混合溶液、壳聚糖盐酸盐溶液和交联剂或者固化剂都经过湿热灭菌，灭菌温度为121.0℃，灭菌时间为15min。以下实施例中的“冻干保护剂”是指可以在冷冻干燥过程及冻干后储存阶段保护菌体抵抗低温损害的物质。其分类方法有多种：根据物质的种类可以分为糖类、多元醇类、聚合物类、氨基酸类、盐类等；根据渗透性可以分为高渗透性物质(如甘油、DMSO)、中渗透性物质(如葡萄糖、甘氨酸)和低渗透性物质(如可溶性淀粉、HPMC)等；根据分子量可以分为高分子物质和低分子物质。其中，海藻糖、右旋糖酐40、甘油、乳糖等具有优异的冻干保护作用。甘油可以起到缓冲作用，降低低温作用对菌体的损害，而且还能够在细胞表面形成保护层，减少细胞暴露在介质中的面积，起到保护作用。右旋糖酐能够聚集在嗜热链球菌周围，从而能够有利于细胞膜保持完整并能够起到平衡渗透压的作用，使得嗜热链球菌取得较高的冻干存活率。冷冻干燥过程中海藻糖可以在菌体内部聚集二糖尤其是海藻糖分子。这些海藻糖分子能够代替水分子通过氢键与细胞膜上的蛋白质连接从而保证膜在冻干过程中的完整性。以下是实施例和对比例部分。实施例1耐酸、稳定的益生菌微胶囊及其制备方法本实施例提供一种耐酸、稳定的益生菌微胶囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：1)菌种活化与增殖培养将嗜酸链球菌种接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于37.0℃下培养26h，再按体积比为5.0％的比例(即每100mL培养基中接种5mL菌种)接种于MRS液体培养基中，并在相同条件下活化至第三代，得到菌液。2)收集菌体将菌液在10.0℃、3000rpm下离心20min，弃去上清液，获得菌泥。3)益生菌微胶囊的制备称取8.5g的海藻糖加入到100.0mL的蒸馏水中，搅拌溶解，再称取3g海藻酸钠粉末静置溶解在上述制备的海藻糖溶液中，随后将所得溶液在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却后，按照质量比为4:1的比例与菌泥混合均匀后，通过微胶囊造粒仪，在蠕动泵泵速10ml·min-1、1200Hz的振动频率下，形成液滴，垂直滴入0.3MCaCl2溶液中，固化30min，洗涤过滤，备用。4)壳聚糖盐酸盐包衣稀释壳聚糖盐酸盐至12％(m/v)，在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却。将步骤3)所得物加入到壳聚糖盐酸盐溶液中，磁力搅拌45min，洗涤过滤，得到壳聚糖盐酸盐-海藻糖-海藻酸钠微胶囊。5)冷冻干燥将步骤4)所得微胶囊加入到体积分数为8.5％的海藻糖溶液中，平衡30min，随后放到-45.0℃冰箱中预冻4h，再在-40.0℃下真空冷冻干燥36h，得到壳聚糖盐酸盐-海藻糖-海藻酸钠微胶囊制剂，即为本实施例的益生菌微胶囊制剂。采用扫描电镜观测微胶囊形态，可以看到在600倍视野下，微胶囊的形态及粒径均一，对益生菌有良好的包埋效果(图1)。实施例2～5耐酸、稳定的益生菌微胶囊及其制备方法本实施例提供一种耐酸、稳定的益生菌微胶囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：1)菌种活化与增殖培养将保加利亚乳杆菌菌种接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于37.0℃下培养20h，再按体积比为5.0％的比例(即每100mL培养基中接种5mL菌种)接种于MRS液体培养基中，并在相同条件下活化至第三代，得到菌液。2)收集菌体将菌液在5.0℃、2500rpm下离心20min，弃去上清液，获得菌泥。3)益生菌微胶囊的制备称取12.0g甘油加入到100.0mL的蒸馏水中，溶解，再称取4.0g明胶粉末溶解在上述制备的甘油溶液中，静置溶解。随后将所得溶液在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却后，按照质量比为1：1(实施例2)、2：1(实施例3)、4：1(实施例4)及5：1(实施例5)的比例与菌泥混合均匀后，通过微胶囊造粒仪，在蠕动泵泵速6ml·min-1、1000Hz的振动频率下，形成液滴，在垂直滴入硫酸钠水溶液溶液中，交联30min，分别制备得到四个不同的处方，洗涤过滤，备用。4)壳聚糖盐酸盐包衣稀释壳聚糖盐酸盐至8％(m/v)，在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却。将步骤3)所得物加入到壳聚糖盐酸盐溶液中，磁力搅拌30min，洗涤过滤，得到壳聚糖盐酸盐-甘油-明胶微胶囊。5)冷冻干燥将步骤4)所得微胶囊加入到体积分数为12％的甘油溶液中，平衡30min，随后放到-45.0℃冰箱中预冻4h，再在-40.0℃下真空冷冻干燥40h，得到壳聚糖盐酸盐-甘油-明胶微胶囊制剂，即为实施例2～5的益生菌微胶囊制剂。实施例6耐酸、稳定的益生菌微胶囊及其制备方法本实施例提供一种耐酸、稳定的益生菌微胶囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：1)菌种活化与增殖培养将双歧杆菌菌种接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于38.0℃下培养26h，再按体积比为8.0％的比例(即每100mL培养基中接种8mL菌种)接种于MRS液体培养基中，并在相同条件下活化至第三代，得到菌液。2)将菌液在0.0℃、4000rpm下离心10min，弃去上清液，获得菌泥。3)益生菌微胶囊的制备称取5.0g右旋糖酐40加入到100.0mL的蒸馏水中，溶解。再称取2.0g海藻酸钠粉末溶解在上述制备的右旋糖酐40溶液中，静置溶解。随后将所得溶液在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却后，按照质量比为4:1的比例与菌泥混合均匀后，通过微胶囊造粒仪，在蠕动泵泵速15ml·min-1、2000Hz的振动频率下，形成液滴，在垂直滴入0.3MCaCl2溶液中，固化40min，洗涤过滤，备用。4)壳聚糖盐酸盐包衣稀释壳聚糖盐酸盐至7％(m/v)，在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却。将步骤3)所得物加入到壳聚糖盐酸盐溶液中，磁力搅拌60min，洗涤过滤，得到壳聚糖盐酸盐-右旋糖酐40海藻酸钠微胶囊。5)冷冻干燥将步骤4)所得微胶囊加入到体积分数为5.0％的右旋糖酐40溶液中，平衡30min，随后放到-45.0℃冰箱中预冻6h，再在-40.0℃下真空冷冻干燥36h，得到壳聚糖盐酸盐-右旋糖酐40海藻酸钠微胶囊制剂，即为实施例6的益生菌微胶囊制剂。对比例1本对比例提供一种壳聚糖盐酸盐-明胶微胶囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：1)菌种活化与增殖培养将嗜热链球菌菌种接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于37.0℃下培养24h，再按体积比为5.0％的比例接种于MRS液体培养基中，即每100mL培养基中接种5mL菌种，并在相同条件下活化至第三代，得到菌液。2)收集菌体将菌液在5.0℃、3000rpm下离心15min，弃去上清液，获得菌泥。菌泥用灭菌纯化水重新分散后即获得芯材；3)微胶囊的制备称取3g明胶溶于100.0mL的蒸馏水中，搅拌溶解，随后将所得溶液在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却后，按照质量比为2:1的比例与芯材混合均匀，通过微胶囊造粒仪，在600HZ的振动频率下，滴入硫酸钠水溶液中，交联30min，洗涤过滤，备用。4)壳聚糖盐酸盐包衣稀释壳聚糖盐酸盐至10％(m/v)，在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却。将步骤3)所得物加入到壳聚糖盐酸盐溶液中，磁力搅拌60min，洗涤过滤，得到壳聚糖盐酸盐-明胶微胶囊。5)冷冻干燥将步骤4)所得微胶囊放到-45.0℃冰箱中预冻4h，再在-40.0℃下真空冷冻干燥36h，得到嗜热链球菌明胶微胶囊制剂。对比例2本对比例提供一种海藻糖-明胶微胶囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：1)菌种活化与增殖培养将双歧杆菌菌种接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于38.0℃下培养28h，再按体积比为6.0％的比例(即每100mL培养基中接种6mL菌种)接种于MRS液体培养基中，并在相同条件下活化至第三代，得到菌液。2)将菌液在0.0℃、3000rpm下离心15min，弃去上清液，获得菌泥。3)益生菌微胶囊的制备称取5.0g海藻糖加入到100.0mL的蒸馏水中，溶解。再称取3.0g海藻酸钠粉末溶解在上述制备的海藻糖溶液中，静置溶解。随后将所得溶液在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却后，按照质量比为4:1的比例与菌泥混合均匀后，通过微胶囊造粒仪，在蠕动泵泵速10ml·min-1、2200Hz的振动频率下，形成液滴，在垂直滴入硫酸钠水溶液中，交联30min，洗涤过滤，备用。4)冷冻干燥将步骤3)所得微胶囊加入到体积分数为5.0％的海藻糖溶液中，平衡30min，随后放到-45.0℃冰箱中预冻6h，再在-40.0℃下真空冷冻干燥36h，得到海藻糖-明胶微胶囊制剂，即为对比例2的益生菌微胶囊制剂。对比例3本对比例提供一种壳聚糖盐酸盐-右旋糖酐40-海藻酸钠微胶囊及其制备方法，该制备方法包括以下步骤：1)菌种活化与增殖培养将保加利亚乳杆菌菌种接种到已灭菌的MRS液体培养基中，于37.0℃下培养26h，再按体积比为5.0％的比例(即每100mL培养基中接种5mL菌种)接种于MRS液体培养基中，并在相同条件下活化至第三代，得到菌液。2)将菌液在0.0℃、3000rpm下离心15min，弃去上清液，获得菌泥。3)益生菌微胶囊的制备称取5.0g右旋糖酐40加入到100.0mL的蒸馏水中，溶解。再称取3.0g海藻酸钠粉末溶解在上述制备的右旋糖酐40溶液中，静置溶解。随后将所得溶液在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却后，按照质量比为3:1的比例与菌泥混合均匀后，通过点胶机，利用空压机空气压力将溶液通过针筒崩出，形成液滴，在垂直滴入0.2MCaCl2溶液中，固化30min，洗涤过滤，备用。4)壳聚糖盐酸盐包衣稀释壳聚糖盐酸盐至8％(m/v)，在121.0℃下高压灭菌15min，放置冷却。将步骤3)所得物加入到壳聚糖盐酸盐溶液中，磁力搅拌40min，洗涤过滤，得到壳聚糖盐酸盐-右旋糖酐40-海藻酸钠微胶囊。5)冷冻干燥将步骤4)所得微胶囊加入到体积分数为5.0％的右旋糖酐40溶液中，平衡30min，随后放到-45.0℃冰箱中预冻5h，再在-40.0℃下真空冷冻干燥38h，得到壳聚糖盐酸盐-右旋糖酐40-海藻酸钠微胶囊制剂，即为实施例6的益生菌微胶囊制剂。试验例1本发明实施例和对比例的益生菌微胶囊制剂冻干前后的活性通过活菌计数法计数，检测本发明实施例和对比例的益生菌微胶囊制剂冻干前后的活性，结果见表1。表1冻干前后存活率的比较结果比例冻干前的活菌数(CFU/g)冻干后的活菌数(CFU/g)实施例14.63×1092.16×108实施例26.63×10113.24×108实施例34.86×10102.04×109实施例41.32×10101.78×109实施例59.36×1091.02×109实施例66.48×1098.33×107对比例13.76×1092.63×106对比例22.86×1097.63×108对比例36.76×1098.32×108通过表1中各实施例与对比例冻干前后的活性结果可得，含有冻干保护剂的组别冷冻干燥之后活性维持较高，对比例1中因不含冻干保护剂，其活性下降较多。实施例2-5中，随着比例的上升，冷冻干燥前每个单位的微胶囊活菌数呈现将趋势，这是因为比例的上升会使使用的菌泥量下降，但通过冷冻干燥后活性对比可以发现，原始活菌数较多并不能保证冷冻干燥后活性也高，这可能是因为实施例2中冷冻干燥前一部分益生菌并没有被包埋到微胶囊里，在冷冻干燥过程中未能受到冻干保护剂的保护。对比例2中，因添加了冻干保护剂，即使在没有包衣的情况下，冻干保护剂也可以对益生菌产生一定的保护作用，因此其冷冻干燥后结果与实施例相差不大。对比例3中采用了点胶机配合针筒针头的设备进行制备微胶囊，其冻干前后活性与实施例相比没有明显差别，但是在外观上明显粒径较大，且分布不均匀。试验例2实施例6的益生菌微胶囊制剂的长期储存性试验将双歧杆菌冻干菌粉和实施例6的益生菌微胶囊制剂分别在4℃下和25℃下分别储存0d、30d、60d、90d后，检测微胶囊中的益生菌活菌数，结果如图3所示。由检测结果可以看出，随着时间的延长，微胶囊中的活菌数均有下降，在25℃下下降的幅度更大，无论温度为4.0℃还是25.0℃时，与双歧杆菌冻干菌粉相比，本发明实施例6的双歧杆菌微胶囊经过长时间的储存后，稳定性较佳，活菌数下降并不明显，仍然能够保持较好的活菌数(b和d)，活菌数达到7.72logCFU/g。说明本发明的益生菌微胶囊具有良好的长期储存性。试验例3本发明实施例和对比例的益生菌微胶囊的耐酸试验对对比例和实施例1-6中制备的冻干后的益生菌微胶囊进行酸处理，酸处理方法为：放置在模拟人工胃液中2h，再分离出微胶囊，洗涤后，测定活菌数，结果如表2所示。表2酸处理后不同微胶囊中的活菌数对比项目酸处理前活菌数(CFU/g)酸处理后活菌数(CFU/g)实施例12.16×1081.67×107实施例23.24×1085.73×107实施例32.04×1095.34×107实施例41.78×1094.25×107实施例51.02×1090.45×107实施例68.33×1076.81×106对比例12.63×1063.21×105对比例27.63×1082.73×105对比例38.32×1083.32×107由表2数据可以看出，本发明的益生菌微胶囊在经过酸处理后，活菌数能够保持106CFU/g的活菌数，而对比例1-2的益生菌微胶囊酸处理后活菌数下降较为明显，且未能达到106CFU/g的最低标准，主要是因为对比例1中因为不含有冻干保护剂因此原始活性较低，而对比例2中因为含有冻干保护剂，原始活性较高，但是没有包衣的情况下，其耐酸性较实施例有明显差别。对比例3中采用了点胶机配合针筒针头的设备进行制备微胶囊，其耐酸性保持也较好，但是在外观上明显粒径较大，且分布不均匀。说明本发明实施例的益生菌微胶囊能够保持优异的耐酸性能。试验例4本发明实施例和对比例的益生菌微胶囊的稳定性测试对对比例、实施例1-6中制备的益生菌微胶囊分别进行稳定性测试，测试方法为：在4.0℃下储存90天，测定活菌数，结果如表3所示。表3储存90天后不同微胶囊中的活菌数对比项目储存前活菌数(CFU/g)储存90天后活菌数(CFU/g)实施例12.16×1089.23×107实施例23.24×1088.73×108实施例32.04×1096.95×108实施例41.78×1094.23×108实施例51.02×1094.11×108实施例68.33×1077.58×107对比例12.63×1064.25×105对比例27.63×1083.73×106对比例38.32×1085.73×107由表3数据可以看出，本发明的益生菌微胶囊在4℃下储存90天后，活菌数能够保持107CFU/g的活菌数。而对比例1中的益生菌微胶囊在90天后活性下降较为明显，主要是因为冻干后原始活性较低，对比例2中因为缺少壳聚糖的包衣，在储存过程中容易受到空气中水分的影响，降低其存活率，因此活性下降也较快。对比例3中采用了点胶机配合针筒针头的设备进行制备微胶囊，其长期稳定性有一定的保持效果，但是在外观上明显粒径较大，且分布不均匀。说明本发明的益生菌微胶囊具有优异的储存稳定性。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页1 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