专利名称：一种微生态制剂－四联活菌制剂及其制备方法
技术领域：
一种微生态制剂——四联活菌制剂及其制备方法，属于微生态制剂技术领域。
背景技术：
近年来，随着我国水产养殖业的迅速发展，高密度、集约化的水产养殖规模的日益扩大，养殖水体中高浓度的水产动物排泄物、大量投喂饵料造成的饵料残余及污水的任意排放造成的天然水域的污染，使养殖生态环境日益恶化。水产动物尤其是虾蟹等甲壳类动物，免疫系统功能低下，主要依靠各种血细胞产生的非特异性物质如凝聚素溶菌酶等来发挥机体的非特异性免疫功能，在恶化的养殖水体环境中，易受致病细菌和病毒的攻击，使各类疾病多发，降低养殖经济效益。水产动物疾病尤其是病毒病大部分都发展快，危害大。通常的防治方法是施用一些抗生素和化学合成药物对水体进行消毒、净化处理，对环境及水产动物体内病菌的杀灭，从而达到控制疾病的效果。这种方法对于某些养殖环境恶化较为严重及细菌感染有一定的控制作用，但对于大多数苗种场，由于水产苗种抗病能力十分低下，且一旦患病就会出现大量死亡，使用药物治疗无明显的效果。
抗生素及化学合成药物长期使用或滥用，不仅导致病原菌的抗药性耐药性越来越明显，用药量也随之增大，使用效果越来越差，甚至无效，而且造成药物在水产品中残留，降低了水产品的品质。此外，抗生素及化学合成药物在杀灭病源菌的同时，也干扰了水产动物体内及养殖水体有益微生物菌群的正常生长繁殖，减弱水产动物自身抗疾病能力，使水体及池底的污染物及残饵得不到及时有效的分解，水质逐渐恶化，破坏水体的生态平衡，从而诱发新一轮病害。因此，抗生素及化学药品是一种被动的疾病防治办法，不能从根本上提高水产动物的抗病能力，其作为一种应急手段来控制病害时，负面效果是显而易见的。
用微生态制剂(Microbial ecological agent)进行水产养殖动物病害的防治是近年发展起来的一种新方法，具有无毒、无副作用、无残留的优点。微生态制剂是基于微生态平衡理论、微生态营养理论及微生态防治理论而发展起来的微生物产品，它对动物疾病的防治是一种主动形式的防治，通过制剂中有益菌群来调整动物体内在营养、免疫、生长刺激、生物拮抗等方面发挥着重要作用的微生态平衡，抑制致病菌的生长，促进动物自身有益微生物的生长，增强其微生态的自我调节能力，防治并减少疾病的发生，提高宿主健康水平。在水产养殖中应用的微生态制剂，还能通过对水体有害物质的分解、病原菌的抑制及水体有益菌群的培育，来改善水质，维持水体生态平衡。
微生态制剂起初多用于治疗人体的疾病，随后微生态制剂开始用于养殖动物的疾病防治，用于制备饲用微生态制剂的微生物种类也日益增多，应用广泛。1989年美国食品与药物管理局(FDA)和美国饲料控制官员协会公布了可以直接饲喂且一般认为是安全的微生物菌种名单，共有41种，年使用量在8000吨以上。我国农业部2003年也已公布了干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母等15种可以直接使用的饲料级微生物添加剂菌种。目前，国内微生态制剂主要应用于猪牛鸡等禽畜养殖中，在水产品动物养殖中的应用处于起步阶段。
在水产养殖中应用的微生态制剂按所含微生物种类的数量，可分为两大类，即单一菌株型和多菌株复合型。单一菌株型如光合细菌制剂、芽孢杆菌制剂等，仅含一种微生物，无多菌种协同作用的优势，相对来说存在作用单一、作用不持久的局限。因此，多菌株混合型制剂在水产养殖中的应用更多，常见有采用芽孢杆菌、硝化细菌、或光合细菌等按比例混合而成的混合型制剂。对此类混合型制剂的制备来说，微生物种类的选择、配伍及制备工艺是关键，直接影响制剂的应用效果。
目前常见的水产养殖用微生态制剂如光合细菌制剂、芽孢杆菌制剂、硝化细菌制剂等，主要是利用光合细菌、芽孢杆菌、硝化细菌等微生物分解水体中过量的残余饵料、排泄废物、动植物残体等对水产动物有害的有机和无机物质、抑制病原菌的生长，通过养殖水体环境的改善来达到对疾病的防治效果。此外，有的制剂如光合细菌制剂，其微生物自身富含蛋白质等营养物质，通过被吞食为动物补充营养，促进生长，增强对疾病抵抗能力。因此，这些产品对水产动物病害的防治是通过从改善水体环境或补充营养的角度来实现的，并不直接通过参与水产动物体内微生态平衡的调整，来抑制致病菌的生长，促进动物自身有益微生物的生长，增强其微生态的自我调节能力，提高水产动物自身抗病能力。由此，基于上述背景，如果可以开发出兼有直接参与水产动物体内微生态平衡的调整、促进生长，同时又能改善水质的微生态制剂，应用于水产养殖的疾病防治，则对减少抗生素和化学药物的使用，生产无污染的绿色水产品，提高养殖经济效益具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于获得一种水产养殖用微生态制剂-四联活菌制剂的配方组成及其制备方法。
本发明的技术方案“四联活菌制剂”是多菌株混合型活菌制剂，以酪酸梭状芽孢杆菌、干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌四种有益微生物及生物活性钙-L-乳酸钙为特征组分进行配伍，采用通用发酵罐纯种培养或混合培养四种微生物，低温干燥制备活菌原菌粉，按特定配比复配而成。
该四联活菌制剂是由酪酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)CGMCCNo.1647、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CGMCC 1.539、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC 1.1414和酵母菌(Sacccharomycescerevisiae)CGMCC 2.614四种益生菌与L-乳酸钙和沸石粉复配而成；制剂中活菌总数分别为枯草芽孢杆菌活菌总数≥1×107CFU/克，酪酸梭状芽孢杆菌活菌总数≥1×108CFU/克，干酪乳杆菌活菌总数≥1×109CFU/克，酵母菌活菌总数≥1×106CFU/克，制剂中L-乳酸钙的质量含量为6％-10％，沸石粉的质量含量为40％-45％。
该四联活菌制剂是以微生物纯种培养获得的原菌粉配制而得，其质量百分配比(1)为枯草芽孢杆菌原菌粉2-2.5酪酸梭状芽孢杆菌原菌粉20-25干酪乳杆菌原菌粉5-6.5酵母菌原菌粉20-25L-乳酸钙6-10沸石粉40-45其中枯草芽孢杆菌原菌粉中枯草芽孢杆菌活菌数≥5×108CFU/克酪酸梭状芽孢杆菌原菌粉中酪酸梭状芽孢杆菌活菌数≥5×108CFU/克干酪乳杆菌原菌粉中干酪乳杆菌活菌数≥2×1010CFU/克酵母菌原菌粉中酵母菌活菌数≥5×106CFU/克。
或该四联活菌制剂是以枯草芽孢杆菌纯种培养获得的原菌粉和以酪酸梭状芽孢杆菌、干酪乳杆菌与酵母菌的混合培养获得的含酪酸梭状芽孢杆菌、干酪乳杆菌与酵母菌的混合原菌粉配制而得，其质量百分配比(2)为枯草芽孢杆菌原菌粉2-2.5混合原菌粉45-52L-乳酸钙6-10沸石粉40-45其中枯草芽孢杆菌原菌粉中枯草芽孢杆菌活菌数≥5×108CFU/克，混合原菌粉中酪酸梭状芽孢杆菌活菌数≥2.4×108CFU/克，干酪乳杆菌活菌数≥2.4×109CFU/克，酵母菌活菌数≥2.4×106CFU/克。
该四联活菌制剂的制备方法是由酪酸梭状芽孢杆菌(Clostridiumbutyricum)CGMCC No.1647、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CGMCC 1.539、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC 1.1414和酵母菌(Sacccharomycescerevisiae)CGMCC 2.614四种益生菌与L-乳酸钙和沸石粉复配而成。
A.活性菌体的培养和原菌粉的制备(1)制备枯草芽孢杆菌的原菌粉菌种活化枯草芽孢杆菌的冻干菌种，划线接种于营养肉汤琼脂斜面，30-40℃培养18-24小时，然后划线转接于营养肉汤琼脂茄子瓶斜面，30-40℃培养20-24小时，镜检，至90％以上菌体形成芽孢，即为成熟。
种子培养将成熟菌泥用无菌水刮洗，装入内装玻璃珠的无菌三角瓶，振荡，获得均匀的菌悬液，将菌悬液在70-90℃水浴中加热5-15分钟，以体积比2％-10％的接种量接入0.1m3种子罐，装量系数为60％-70％体积比。
种子培养基组成为葡萄糖3-5g，蛋白胨5-10g，酵母膏3-5g，NaCl 5g，自来水定容至1000ml，pH7.0-7.5，培养条件为搅拌转速100-200r/min，通气量1-2m3/h，培养温度为30-40℃，培养时间为16-20h。
发酵罐培养种子培养液以体积比5％-20％的接种量接入1m3发酵罐，装量系数为60％-70％体积比，发酵罐培养的培养基由碳源、氮源和无机盐组成，碳源用葡萄糖或淀粉，含量为5-15g/L；氮源用蛋白胨、酵母膏、黄豆饼粉或花生饼粉，含量为10-20g/L，无机盐为NaCl 5g/L，培养条件为搅拌转速100-200r/min，通气量1-2m3/h，培养温度为30-40℃，培养时间为16-20h，镜检，至90％以上的菌体已形成芽孢时，放罐结束培养。
菌体收集培养液泵入转速为15000r/min的连续式离心机进行离心，弃上清液，获得湿菌体。
枯草芽孢杆菌原菌粉的制备收集湿菌体，与干淀粉以质量比1∶1-5混合，在40-50℃干燥20-24h，粉碎机粉碎，过40目筛，用干淀粉调节枯草芽孢杆菌的活菌数≥5×108CFU/克，即为枯草芽孢杆菌原菌粉。
(2)制备酪酸梭状芽孢杆菌的原菌粉菌种活化酪酸梭状芽孢杆菌的冻干菌种，接入活化培养基，静置厌氧培养，活化培养基组成蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏3g，葡萄糖10g，可溶性淀粉1g，NaCl5g，NaAc 3g，盐酸半胱氨酸0.5g，CaCO33g，蒸馏水定容至1000ml，pH 7.0，30-40℃培养24-48h，以体积比5％-15％的接种量转接于新鲜活化培养基，30-40℃培养24-48h，镜检，至90％以上菌体形成芽孢时，即为成熟。
种子培养菌液在70-90℃水浴中加热5-15分钟，以体积比2％-10％的接种量接入0.1m3种子罐，装量系数为70％-80％体积比，种子培养基组成为蛋白胨5-10g，牛肉浸膏5-10g，酵母浸膏3-10g，葡萄糖5-10g，淀粉0.5-1g，NaCl 5g，NaAcl-3g，CaCO31-3g，蒸馏水定容至1000ml，pH 7.0，30-40℃静置厌氧培养16-24h。
发酵罐培养种子培养液以体积比5％-20％的接种量接入1m3发酵罐，装量系数为70％-80％体积比，发酵罐培养的培养基组成为蛋白胨5-10g，酵母浸膏3-10g，葡萄糖5-15g，淀粉0.5-1g，NaCl 5g，NaAc 1-3g，CaCO33-10g，自来水定容至1000ml，pH 7.0，30-40℃静置厌氧培养24-48h，镜检，至90％以上菌体形成芽孢时，即放罐结束培养。
菌体收集培养液泵入转速为15000r/min的连续式离心机进行离心，弃上清液，获得湿菌体。
酪酸梭状芽孢杆菌原菌粉的制备将酪酸梭状芽孢杆菌湿菌体与干淀粉以质量量比1∶1-5混合，40-50℃干燥20-24h，粉碎机粉碎，过40目筛，用干淀粉调节酪酸梭状芽孢杆菌的活菌数≥5×108CFU/克，即为酪酸梭状芽孢杆菌原菌粉。
(3)制备干酪乳杆菌原菌粉菌种活化干酪乳杆菌的冻干菌种，接入活化培养基，静置厌氧培养，活化培养基组成为蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏5g，K2HPO42g，柠檬酸二铵2g，NaAc 5g，葡萄糖20g，吐温-80 1g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O 0.05g，CaCO320g蒸馏水定容至1000ml，pH6.8，30-40℃培养24-48h，以体积比5％-15％的接种量转接于新鲜活化培养基，30-40℃培养24-48h。
种子培养活化菌液以体积比2％-10％的接种量接入0.1m3种子罐，装量系数为70％-80％体积比，种子培养基组成蛋白胨5-10g，酵母浸膏3-10g，葡萄糖5-10g，CaCO35-10g，KH2PO41-5g，蒸馏水定容至1000ml，pH6.5-7.0，30-40℃静置厌氧培养24-48h。
发酵罐培养种子培养液以体积比10％-20％的接种量接入1m3发酵罐，装量系数为70％-80％体积比，发酵罐培养的培养基组成葡萄糖10-20g，蛋白胨5-10g，酵母浸膏3-10g，KH2PO41-5g，(NH4)2SO42-5g，CaCO310-20g，自来水定容至1000ml，pH 7.0，30-40℃静置厌氧培养24-48h。
菌体收集培养液泵入转速为15000r/min的连续式离心机进行离心，弃上清液，获得湿菌体。
干酪乳杆菌原菌粉的制备干酪乳杆菌湿菌体与干淀粉以质量比1∶1-5混合，35-45℃干燥20-24h，粉碎机粉碎，过40目筛，用干淀粉调节干酪乳杆菌的活菌数≥2×1010CFU/克，即为干酪乳杆菌原菌粉。
(4)制备酵母菌原菌粉菌种活化酵母菌冻干菌种，接入活化培养基，静置厌氧培养，活化培养基组成为12Brix.麦芽汁，30-40℃培养20-24h，以体积比5％-15％的接种量转接于新鲜活化培养基，30-40℃培养16-20h。
种子培养活化菌液以体积比2％-10％的接种量接入0.1m3种子罐，装量系数为70％-80％体积比，种子培养基组成为酵母浸膏3g，葡萄糖5-10g，(NH4)2SO43g，MgSO4·7H2O0.2g，NaCl 0.1g，KH2PO42g，自来水定容至1000ml，pH4-6，搅拌转速100-150r/min，通气量0.5-1m3/h，28-30℃培养16-20h发酵罐培养种子培养液以体积比5％-10％的接种量接入1m3发酵罐，装量系数为70％-80％体积比，发酵罐培养基组成为酵母浸膏3g，葡萄糖10-15g，(NH4)2SO43g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.1g，自来水定容至1000ml，pH4-6，搅拌转速100-200r/min，通气量1-2m3/h，28-30℃培养20-24h。
菌体收集培养液泵入转速为15000r/min的连续式离心机进行离心，弃上清液，获得湿菌体。
酵母菌原菌粉的制备将酵母菌湿菌体与干淀粉以质量比1∶1-5混合，35-45℃干燥20-24h，粉碎机粉碎，过40目筛，用干淀粉调节酵母菌的活菌数≥5×106CFU/克，即为酵母菌原菌粉。
(5)制备酪酸梭状芽孢杆菌、干酪乳杆菌与酵母菌的混合原菌粉发酵罐培养将酪酸梭状芽孢杆菌、干酪乳杆菌与酵母菌的种子培养液分别以体积比5％-10％、10％-15％、2％-6％的接种量接入1m3发酵罐，装量系数为70％-80％体积比，发酵罐培养基组成为葡萄糖或红糖20-40g，蛋白胨3-8g，酵母浸膏2-6g，KH2PO41-5g，(NH4)2SO42-5g，NaCl 3g，CaCO31-5g，NaAc 1-3g，自来水定容至1000ml，pH 6.5-7.0，30-40℃静置厌氧培养24-48h。
菌体收集培养液泵入转速为15000r/min的连续式离心机进行离心，弃上清液，获得混合湿菌体。
混合原菌粉的制备将混合湿菌体与干淀粉以质量比1∶1-5混合，35-45℃干燥20-24h，粉碎机粉碎，过40目筛，用干淀粉调节酪酸梭状芽孢杆菌活菌数≥2.4×108CFU/克，干酪乳杆菌活菌数≥2.4×109CFU/克，酵母菌活菌数≥2.4×106CFU/克，即为混合原菌粉。
B.四联活菌制剂的配制L-乳酸钙、沸石粉过40目筛后，与原菌粉按配比(1)或配比(2)进行配料，用饲料混合机拌匀，使成品中枯草芽孢杆菌活菌总数≥1×107CFU/克，酪酸梭状芽孢杆菌活菌总数≥1×108CFU/克，干酪乳杆菌活菌总数≥1×109CFU/克，酵母菌活菌总数≥1×106CFU/克，成品采用铝箔袋装。
配比(1)质量百分比为枯草芽孢杆菌原菌粉2-2.5酪酸梭状芽孢杆菌原菌粉20-25干酪乳杆菌原菌粉5-6.5酵母菌原菌粉20-25L-乳酸钙6-10沸石粉40-45其中枯草芽孢杆菌原菌粉中枯草芽孢杆菌活菌数≥5×108CFU/克酪酸梭状芽孢杆菌原菌粉中酪酸梭状芽孢杆菌活菌数≥5×108CFU/克干酪乳杆菌原菌粉中干酪乳杆菌活菌数≥2×1010CFU/克酵母菌原菌粉中酵母菌活菌数≥5×106CFU/克。
配比(2)质量百分比为
枯草芽孢杆菌原菌粉2-2.5混合原菌粉45-52L-乳酸钙6-10沸石粉40-45其中枯草芽孢杆菌原菌粉中枯草芽孢杆菌活菌数≥5×108CFU/克，混合原菌粉中酪酸梭状芽孢杆菌活菌数≥2.4×108CFU/克、干酪乳杆菌活菌数≥2.4×109CFU/克与酵母菌活菌数≥2.4×106CFU/克。
本发明的有益效果本制剂具有不需氧分解有机物的特点，制剂中所含微生物活化快，繁殖能力强，在养殖水体中易形成有益的优势菌。利用其中所含的酪酸梭状芽孢杆菌、干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌四种微生物的厌氧、好氧特性，在增强水产动物抗病能力及养殖水体的水质净化方面发挥协同作用，能替代或部分替代抗生素应用于淡水和海水水产养殖的疾病防治，提高水产养殖经济效益。制剂中L-乳酸钙对水产动物尤其是虾蟹等甲壳类水产动物具有促进脱壳生长、预防软壳症的作用。本制剂的组分均天然存在于自然界，无毒、无副作用、无残留和二次污染，不产生耐药性，在淡水养殖和海水养殖中具有广阔的市场应用。
养殖全过程均可使用本制剂，在养殖水体中泼洒或在水产动物的饵料中添加四联活菌制剂，，每亩每米水深泼洒本制剂100-1000克或在饵料中以质量计添加本制剂0.1％-1％，通过水产动物的吞食，进入水产动物体内，调整其自身的益生菌群平衡，提高免疫机能，增强抗感染能力，维护水产养殖动物体内微生态平衡，防治疾病的发生；酵母菌菌体含有多种维生素和生长因子，对水产动物具有营养作用；L-乳酸钙是L-乳酸的钙盐，L-乳酸天然存在于动物体内，其钙盐-L-乳酸钙在补充水产动物生长所需钙质时，更易吸收利用，对虾蟹等甲壳类水产动物具有促进脱壳生长、预防软壳症的作用。
在养殖水体中泼洒本制剂，能高效分解塘底污染、排泄废物、残余饵料、动植物残体等对水产动物有害物质，净化水质，改善养殖水体环境，抑制病原菌的生长，增强对疾病的防治效果。
生物材料样品保藏及来源说明酪酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)JSIM-MCB20040312保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏日期为2006年3月10日，保藏号为CGMCC No.1647。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)购自CGMCC，菌株编号1.1414，参见CGMCC菌种目录 第三版，1997，细菌P12，倒数第3种。
干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)购自CGMCC，菌株编号1.539，参见CGMCC菌种目录 第三版，1997，细菌P43，第2种。
酵母(Sacccharomyces cerevisiae)购自CGMCC，菌株编号2.614，参见CGMCC菌种目录第三版，1997，酵母菌P80，第7种。
图1四联活菌制剂制备工艺框图。
具体实施方案实施例1活菌体的纯种培养(1)枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis CGMCC1.1414)的纯种培养菌种活化无菌开启枯草芽孢杆菌的冻干菌种，划线接种于试管营养肉汤琼脂斜面，37℃培养18-24h，然后划线转接于营养肉汤琼脂茄子瓶斜面，37℃培养20-24h，镜检，当90％以上菌体形成芽孢时，即为成熟，准备移种。
种子培养准备一个内装玻璃珠的无菌三角瓶，用无菌水将茄子瓶斜面上的成熟菌泥刮洗下来，装入三角瓶，振荡分散菌泥，获得均匀的菌悬液。将菌悬液在85℃水浴中加热5分钟，以体积比5％的接种量接入0.1m3种子罐.种子罐的装量系数为60％(v/v)。
种子培养基组成为葡萄糖3g，蛋白胨5g，酵母膏3g，NaCl 5g，自来水定容至1000ml，pH 7.0-7.5，37℃培养17h，搅拌转速150r/min，通气量1-2m3/h。
发酵罐培养种子培养液以体积比10％的接种量接入1m3发酵罐，装量系数为65％(v/v)，发酵罐培养的培养基组成为葡萄糖10g，黄豆饼粉10g，无机盐为NaCl 5g，自来水定容至1000ml，37℃培养20h，搅拌转速150r/min，通气量1.5m3/h。在培养过程中根据泡沫的高涨情况，加豆油或泡敌进行消泡，防止因泡沫逃逸出发酵罐而引起杂菌污染的情况。取发酵液进行镜检，当90％以上的菌体已形成芽孢时，即放罐结束培养。
菌体收集将培养液泵入转速为15000r/min的连续式离心机进行离心，弃上清液，获得湿菌体，供制备枯草杆菌原菌粉。
(2)酪酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum JSIM-MCB-20040312)的纯种培养菌种活化无菌开启酪酸梭状芽孢杆菌的冻干菌种，接入装有活化培养基的试管，进行静置厌氧培养。活化培养基组成为蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏3g，葡萄糖10g，可溶性淀粉1g，NaCl 5g，NaAc 3g，盐酸半胱氨酸0.5g，CaCO33g，蒸馏水定容至1000ml，pH7.0，37℃培养24h，然后以体积比10％的接种量转接于新鲜活化培养基，37℃培养35h，镜检，当90％以上菌体形成芽孢时，即成熟，准备移种。
种子培养活化菌液在85℃水浴中加热5分钟，以体积比10％的接种量接入0.1m3种子罐，装量系数为80％(v/v)。种子培养基组成为蛋白胨5g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏3g，葡萄糖5g，淀粉0.5g，NaCl 5g，NaAc 3g，CaCO31g，蒸馏水定容至1000ml，pH7.0，37℃静置厌氧培养20h。
发酵罐培养种子培养液以体积比10％的接种量接入1m3发酵罐，装量系数为80％(v/v)，发酵罐培养基组成为蛋白胨7g，酵母浸膏3g，葡萄糖5g，可溶性淀粉1g，NaCl 5g，NaAc 3g，CaCO33g，自来水定容至1000ml，pH 7.0，37℃静置厌氧培养40h，镜检，当90％以上菌体形成芽孢时，即放罐结束培养。
菌体收集将培养液泵入转速为15000r/min的连续式离心机进行离心，弃上清液，获得湿菌体，供制备酪酸梭状芽孢杆菌原菌粉。
(3)干酪乳杆菌((Lactobacillus casei CGMCC1.539)的纯种培养菌种活化无菌开启干酪乳杆菌的冻干菌种，接入装有活化培养基的试管，进行静置厌氧培养。
活化培养基组成为蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏5g，K2HPO42g，柠檬酸二铵2g，NaAc 5g，葡萄糖20g，吐温-80 1g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O0.05g，CaCO320g蒸馏水定容至1000ml，pH6.8，30℃培养30h，然后以体积比8％的接种量转接于新鲜活化培养基，30℃培养24h。
种子培养活化菌液以体积比5％的接种量接入0.1m3种子罐。种子罐的装量系数为80％(v/v)，种子培养基组成为蛋白胨10g，酵母浸膏5g，葡萄糖5g，CaCO37g，KH2PO42g，蒸馏水定容至1000ml，pH6.5-7.0，30℃静置厌氧培养30h。
发酵罐培养种子培养液以体积比15％的接种量接入1m3发酵罐.发酵罐装量系数为80％(v/v)，发酵罐培养的培养基组成为葡萄糖10g，蛋白胨5g，酵母浸膏5g，KH2PO42g，(NH4)2SO43g，CaCO315g，自来水定容至1000ml，pH 7.0，30℃静置厌氧培养36h。
菌体收集将培养液泵入转速为15000r/min的连续式离心机进行离心，弃上清液，获得湿菌体，供制备干酪乳杆菌原菌粉。
(4)酵母菌(Sacccharomyces cerevisiae CGMCC2.614)的纯种培养菌种活化无菌开启酵母的冻干菌种，接入装有活化培养基的试管，进行静置厌氧培养。
活化培养基组成为12Brix.麦芽汁，30℃培养24h，然后以体积比5％的接种量转接于新鲜活化培养基，30℃培养16h。
种子培养活化菌液以体积比5％的接种量接入0.1m3种子罐，装量系数为70％(v/v)，种子培养基组成为酵母浸膏3g，葡萄糖5g，(NH4)2SO43g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.1g，KH2PO42g，自来水定容至1000ml，pH5，30℃培养18h，搅拌转速100r/min，通气量0.5m3/h。
发酵罐培养种子培养液以体积比5％的接种量接1m3发酵罐，装量系数为70％(v/v)，发酵罐培养基组成为酵母浸膏3g，葡萄糖10-15g，(NH4)2SO43g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O0.2g，NaCl 0.1g，自来水定容至1000ml，pH 5，30℃培养20h，搅拌转速100r/min，通气量1m3/h。
菌体收集将培养液泵入转速为15000r/min的连续式离心机进行离心，弃上清液，获得湿菌体，供制备酵母菌原菌粉。
实施例2酪酸梭状芽孢杆菌、干酪乳杆菌与酵母菌活菌体的混合培养菌种活化酪酸梭状芽孢杆菌、干酪乳杆菌、酵母菌冻干菌种的活化与实施例1中所述相同。
种子培养酪酸梭状芽孢杆菌、干酪乳杆菌、酵母菌的种子培养与实施例1中所述相同。
发酵罐培养将酪酸梭状芽孢杆菌、干酪乳杆菌、酵母菌的种子培养液分别以6％、12％、2％的接种量接入1m3发酵罐，装量系数为80％(v/v)。
发酵罐培养基组成为红糖20g，蛋白胨5g，酵母浸膏3g，KH2PO41g，(NH4)2SO42g，NaCl 3g，CaCO33g，NaAc 3g，自来水1000ml，pH 7.0，35℃静置厌氧培养48h。
菌体收集将培养液泵入转速为15000r/min的连续式离心机进行离心，弃上清液，获得湿菌体，供制备酪酸梭状芽孢杆菌、干酪乳杆菌和酵母菌的混合原菌粉。
实施例3微生物纯菌种原菌粉的制备(1)枯草芽孢杆菌原菌粉将纯种培养后收集的枯草芽孢杆菌湿菌体与干淀粉以质量比例1∶2进行混合，在40-50℃下低温干燥20-24h，粉碎机粉碎，过40目筛，用干淀粉调节原菌粉中枯草芽孢杆菌的活菌总数≥5×108CFU/克。
(2)酪酸梭状芽孢杆菌原菌粉将纯种培养后收集的酪酸梭状芽孢杆菌湿菌体与干淀粉以质量比例1∶2.5进行混合，在40-50℃下低温干燥20-24h，粉碎机粉碎，过40目筛，用干淀粉调节原菌粉中酪酸梭状芽孢杆菌的活菌总数≥5×108CFU/克。
(3)干酪乳杆菌原菌粉将纯种培养后收集的干酪乳杆菌湿菌体与干淀粉以质量比1∶2混合，在35-45℃下低温干燥20-24h，粉碎机粉碎，过40目筛，用干淀粉调节原菌粉中干酪乳杆菌的活菌总数≥2×1010CFU/克。
(4)酵母菌原菌粉将纯种培养后收集的酪酸梭状芽孢杆菌湿菌体与干淀粉以质量比1∶5混合，在35-45℃下低温干燥20-24h，粉碎机粉碎，过40目筛，用干淀粉调节原菌粉中酵母菌的活菌总数≥5×106CFU/克。
实施例4混合原菌粉的制备将酪酸梭状芽孢杆菌、干酪乳杆菌和酵母菌混合培养后收集的混合湿菌体与干淀粉以质量比例1∶2进行混合，在35-45℃下低温干燥20-24h，粉碎机粉碎，过40目筛，用干淀粉调节混合原菌粉中酪酸梭状芽孢杆菌活菌总数≥2.4×108CFU/克，干酪乳杆菌活菌总数≥2.4×109CFU/克，酵母菌活菌总数≥2.4×106CFU/克。
实施例5四联活菌制剂成品的制备L-乳酸钙、沸石粉过40目筛后，与原菌粉按下表所列的配比，用饲料混合机拌匀，使成品中枯草芽孢杆菌活菌总数≥1×107CFU/克，酪酸梭状芽孢杆菌活菌总数≥1×108CFU/克，干酪乳杆菌活菌总数≥1×109CFU/克，酵母菌活菌总数≥1×106CFU/克。成品采用铝箔袋装，每袋装量1kg，15袋为1个纸箱包装，纸箱材料采用瓦楞纸。
表1 按配比(1)的5例质量百分组成
表2 按配比(2)的4例质量百分组成
权利要求
1.一种四联活菌制剂，其特征是由酪酸梭状芽孢杆菌(Clostridiumbutyricum)CGMCC No.1647、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CGMCC 1.539、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC 1.1414和酵母菌(Sacccharomycescerevisiae)CGMCC 2.614四种益生菌与L-乳酸钙和沸石粉复配而成；制剂中活菌总数分别为枯草芽孢杆菌活菌总数≥1×107CFU/克，酪酸梭状芽孢杆菌活菌总数≥1×108CFU/克，干酪乳杆菌活菌总数≥1×109CFU/克，酵母菌活菌总数≥1×106CFU/克，制剂中L-乳酸钙的质量含量为6％-10％，沸石粉的质量含量为40％-45％。
2.根据权利要求1所述的四联活菌制剂，其特征是以微生物纯种培养获得的原菌粉配制而得，其质量百分配比(1)为枯草芽孢杆菌原菌粉2-2.5酪酸梭状芽孢杆菌原菌粉20-25干酪乳杆菌原菌粉5-6.5酵母菌原菌粉20-25L-乳酸钙6-10沸石粉40-45其中枯草芽孢杆菌原菌粉中枯草芽孢杆菌活菌数≥5×108CFU/克酪酸梭状芽孢杆菌原菌粉中酪酸梭状芽孢杆菌活菌数≥5×108CFU/克干酪乳杆菌原菌粉中干酪乳杆菌活菌数≥2×1010CFU/克酵母菌原菌粉中酵母菌活菌数≥5×106CFU/克。
3.根据权利要求1所述的四联活菌制剂，其特征是以枯草芽孢杆菌纯种培养获得的原菌粉和以酪酸梭状芽孢杆菌、干酪乳杆菌与酵母菌的混合培养获得的含酪酸梭状芽孢杆菌、干酪乳杆菌与酵母菌的混合原菌粉配制而得，其质量百分配比(2)为枯草芽孢杆菌原菌粉2-2.5混合原菌粉45-52L-乳酸钙6-10沸石粉40-45其中枯草芽孢杆菌原菌粉中枯草芽孢杆菌活菌数≥5×108CFU/克，混合原菌粉中酪酸梭状芽孢杆菌活菌数≥2.4×108CFU/克，干酪乳杆菌活菌数≥2.4×109CFU/克，酵母菌活菌数≥2.4×106CFU/克。
4.一种如权利要求1、2或3所述四联活菌制剂的制备方法，其特征是由酪酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)CGMCC No.1647、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CGMCC 1.539、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC 1.1414和酵母菌(Sacccharomyces cerevisiae)CGMCC 2.614四种益生菌与L-乳酸钙和沸石粉复配而成；A.活性菌体的培养和原菌粉的制备(1)制备枯草芽孢杆菌的原菌粉菌种活化枯草芽孢杆菌的冻干菌种，划线接种于营养肉汤琼脂斜面，30-40℃培养18-24小时，然后划线转接于营养肉汤琼脂茄子瓶斜面，30-40℃培养20-24小时，镜检，至90％以上菌体形成芽孢，即为成熟；种子培养将成熟菌泥用无菌水刮洗，装入内装玻璃珠的无菌三角瓶，振荡，获得均匀的菌悬液，将菌悬液在70-90℃水浴中加热5-15分钟，以体积比2％-10％的接种量接入0.1m3种子罐，装量系数为60％-70％体积比，种子培养基组成为葡萄糖3-5g，蛋白胨5-10g，酵母膏3-5g，NaCl 5g，自来水定容至1000ml，pH7.0-7.5，培养条件为搅拌转速100-200r/min，通气量1-2m3/h，培养温度为30-40℃，培养时间为16-20h；发酵罐培养种子培养液以体积比5％-20％的接种量接入1m3发酵罐，装量系数为60％-70％体积比，发酵罐培养的培养基由碳源、氮源和无机盐组成，碳源用葡萄糖或淀粉，含量为5-15g/L；氮源用蛋白胨、酵母膏、黄豆饼粉或花生饼粉，含量为10-20g/L，无机盐为NaCl 5g/L，培养条件为搅拌转速100-200r/min，通气量1-2m3/h，培养温度为30-40℃，培养时间为16-20h，镜检，至90％以上的菌体已形成芽孢时，放罐结束培养；菌体收集培养液泵入转速为15000r/min的连续式离心机进行离心，弃上清液，获得湿菌体；枯草芽孢杆菌原菌粉的制备收集湿菌体，与干淀粉以质量比1∶1-5混合，在40-50℃干燥20-24h，粉碎机粉碎，过40目筛，用干淀粉调节枯草芽孢杆菌的活菌数≥5×108CFU/克，即为枯草芽孢杆菌原菌粉；(2)制备酪酸梭状芽孢杆菌的原菌粉菌种活化酪酸梭状芽孢杆菌的冻干菌种，接入活化培养基，静置厌氧培养，活化培养基组成蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏3g，葡萄糖10g，可溶性淀粉1g，NaCl5g，NaAc 3g，盐酸半胱氨酸0.5g，CaCO33g，蒸馏水定容至1000ml，pH 7.0，30-40℃培养24-48h，以体积比5％-15％的接种量转接于新鲜活化培养基，30-40℃培养24-48h，镜检，至90％以上菌体形成芽孢时，即为成熟；种子培养菌液在70-90℃水浴中加热5-15分钟，以体积比2％-10％的接种量接入0.1m3种子罐，装量系数为70％-80％体积比，种子培养基组成为蛋白胨5-10g，牛肉浸膏5-10g，酵母浸膏3-10g，葡萄糖5-10g，淀粉0.5-1g，NaCl 5g，NaAc1-3g，CaCO31-3g，蒸馏水定容至1000ml，pH 7.0，30-40℃静置厌氧培养16-24h；发酵罐培养种子培养液以体积比5％-20％的接种量接入1m3发酵罐，装量系数为70％-80％体积比，发酵罐培养的培养基组成为蛋白胨5-10g，酵母浸膏3-10g，葡萄糖5-15g，淀粉0.5-1g，NaCl 5g，NaAc 1-3g，CaCO33-10g，自来水定容至1000ml，pH 7.0，30-40℃静置厌氧培养24-48h，镜检，至90％以上菌体形成芽孢时，即放罐结束培养；菌体收集培养液泵入转速为15000r/min的连续式离心机进行离心，弃上清液，获得湿菌体；酪酸梭状芽孢杆菌原菌粉的制备将酪酸梭状芽孢杆菌湿菌体与干淀粉以质量比1∶1-5混合，40-50℃干燥20-24h，粉碎机粉碎，过40目筛，用干淀粉调节酪酸梭状芽孢杆菌的活菌数≥5×108CFU/克，即为酪酸梭状芽孢杆菌原菌粉；(3)制备干酪乳杆菌原菌粉菌种活化干酪乳杆菌的冻干菌种，接入活化培养基，静置厌氧培养，活化培养基组成为蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏5g，K2HPO42g，柠檬酸二铵2g，NaAc 5g，葡萄糖20g，吐温-801g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O 0.05g，CaCO320g，蒸馏水定容至1000ml，pH6.8，30-40℃培养24-48h，以体积比5％-15％的接种量转接于新鲜活化培养基，30-40℃培养24-48h；种子培养活化菌液以体积比2％-10％的接种量接入0.1m3种子罐，装量系数为70％-80％体积比，种子培养基组成蛋白胨5-10g，酵母浸膏3-10g，葡萄糖5-10g，CaCO35-10g，KH2PO41-5g，蒸馏水定容至1000ml，pH6.5-7.0，30-40℃静置厌氧培养24-48h；发酵罐培养种子培养液以体积比10％-20％的接种量接入1m3发酵罐，装量系数为70％-80％体积比，发酵罐培养的培养基组成葡萄糖10-20g，蛋白胨5-10g，酵母浸膏3-10g，KH2PO41-5g，(NH4)2SO42-5g，CaCO310-20g，自来水定容至1000ml，pH7.0，30-40℃静置厌氧培养24-48h；菌体收集培养液泵入转速为15000r/min的连续式离心机进行离心，弃上清液，获得湿菌体；干酪乳杆菌原菌粉的制备干酪乳杆菌湿菌体与干淀粉以质量比1∶1-5混合，35-45℃干燥20-24h，粉碎机粉碎，过40目筛，用干淀粉调节干酪乳杆菌的活菌数≥2×1010CFU/克，即为干酪乳杆菌原菌粉；(4)制备酵母菌原菌粉菌种活化酵母菌冻干菌种，接入活化培养基，静置厌氧培养，活化培养基组成为12Brix.麦芽汁，30-40℃培养20-24h，以体积比5％-15％的接种量转接于新鲜活化培养基，30-40℃培养16-20h；种子培养活化菌液以体积比2％-10％的接种量接入0.1m3种子罐，装量系数为70％-80％体积比，种子培养基组成为酵母浸膏3g，葡萄糖5-10g，(NH4)2SO43g，MgSO4·7H2O0.2g，NaCl 0.1g，KH2PO42g，自来水定容至1000ml，pH4-6，搅拌转速100-150r/min，通气量0.5-1m3/h，28-30℃培养16-20h；发酵罐培养种子培养液以体积比5％-10％的接种量接入1m3发酵罐，装量系数为70％-80％体积比，发酵罐培养基组成为酵母浸膏3g，葡萄糖10-15g，(NH4)2SO43g，KH2PO42g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaCl 0.1g，自来水定容至1000ml，pH4-6，搅拌转速100-200r/min，通气量1-2m3/h，28-30℃培养20-24h；菌体收集培养液泵入转速为15000r/min的连续式离心机进行离心，弃上清液，获得湿菌体；酵母菌原菌粉的制备将酵母菌湿菌体与干淀粉以质量比1∶1-5混合，35-45℃干燥20-24h，粉碎机粉碎，过40目筛，用干淀粉调节酵母菌的活菌数≥5×106CFU/克，即为酵母菌原菌粉；(5)制备酪酸梭状芽孢杆菌、干酪乳杆菌与酵母菌的混合原菌粉发酵罐培养将酪酸梭状芽孢杆菌、干酪乳杆菌与酵母菌的种子培养液分别以体积比5％-10％、10％-15％、2％-6％的接种量接入1m3发酵罐，装量系数为70％-80％体积比，发酵罐培养基组成为葡萄糖或红糖20-40g，蛋白胨3-8g，酵母浸膏2-6g，KH2PO41-5g，(NH4)2SO42-5g，NaCl 3g，CaCO31-5g，NaAc 1-3g，自来水定容至1000ml，pH 6.5-7.0，30-40℃静置厌氧培养24-48h；菌体收集培养液泵入转速为15000r/min的连续式离心机进行离心，弃上清液，获得混合湿菌体；混合原菌粉的制备将混合湿菌体与干淀粉以质量比1∶1-5混合，35-45℃干燥20-24h，粉碎机粉碎，过40目筛，用干淀粉调节酪酸梭状芽孢杆菌活菌数≥2.4×108CFU/克，干酪乳杆菌活菌数≥2.4×109CFU/克，酵母菌活菌数≥2.4×106CFU/克，即为混合原菌粉；B.四联活菌制剂的配制L-乳酸钙、沸石粉过40目筛后，与原菌粉按配比(1)或配比(2)进行配料，用饲料混合机拌匀，使成品中枯草芽孢杆菌活菌总数≥1×107CFU/克，酪酸梭状芽孢杆菌活菌总数≥1×108CFU/克，干酪乳杆菌活菌总数≥1×109CFU/克，酵母菌活菌总数≥1×106CFU/克，成品采用铝箔袋装；配比(1)质量百分比为枯草芽孢杆菌原菌粉2-2.5酪酸梭状芽孢杆菌原菌粉20-25干酪乳杆菌原菌粉5-6.5酵母菌原菌粉20-25L-乳酸钙6-10沸石粉40-45其中枯草芽孢杆菌原菌粉中枯草芽孢杆菌活菌数≥5×108CFU/克酪酸梭状芽孢杆菌原菌粉中酪酸梭状芽孢杆菌活菌数≥5×108CFU/克干酪乳杆菌原菌粉中干酪乳杆菌活菌数≥2×1010CFU/克酵母菌原菌粉中酵母菌活菌数≥5×106CFU/克。配比(2)质量百分比为枯草芽孢杆菌原菌粉2-2.5混合原菌粉45-52L-乳酸钙6-10沸石粉40-45其中枯草芽孢杆菌原菌粉中枯草芽孢杆菌活菌数≥5×108CFU/克，混合原菌粉中酪酸梭状芽孢杆菌活菌数≥2.4×108CFU/克、干酪乳杆菌活菌数≥2.4×109CFU/克与酵母菌活菌数≥2.4×106CFU/克。
5.一株酪酸梭状芽孢杆菌(Clostridium butyricum)JSIM-MCB20040312，菌株保藏编号为CGMCC No.1647。
全文摘要
一种微生态制剂－四联活菌制剂及其制备方法，属于微生态制剂技术领域。本发明的活菌制剂是以酪酸梭状芽孢杆菌、干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌四种有益微生物及L－乳酸钙为特征组分，采用通用发酵罐纯种或混合培养，低温干燥制备活菌原菌粉，按特定配比复配而成。本制剂利用相关菌株的厌氧、好氧特性，在增强水产动物抗病能力及养殖水体的水质净化方面发挥协同作用，能替代或部分替代抗生素应用于淡水和海水水产养殖的疾病防治，提高水产养殖经济效益。L－乳酸钙组分对虾蟹等甲壳类水产动物具有促进脱壳生长、预防软壳症的作用。本制剂组分无毒、无副作用、无残留和二次污染，不产生耐药性，在淡水养殖和海水养殖中具有广阔的市场应用。
文档编号C02F3/34GK1844364SQ20061004020
公开日2006年10月11日 申请日期2006年5月11日 优先权日2006年5月11日
发明者陆茂林, 孙梅, 匡群, 施大林, 刘淮, 何义进 申请人:江苏省微生物研究所有限责任公司