一种高效分离松茸菌种的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种高效分离松茸菌种的方法。
【背景技术】
[0002]松鸾(Tricholoma matsutake)，又称松口蘑，是著名的食药用真菌，具有很高的药用价值及多种生物活性。现代医学研究表明松茸具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗糖尿病、抗炎，治疗心血管病等功效；同时又因其具有良好的防辐射保健功能，在国际上广受人们追捧，具有极高的经济价值。
[0003]松茸生长条件特殊，需要在特定环境下与松属、栎属的须根产生共生关系，形成菌根，才能进一步长出子实体。松茸的生产只能采取半人工方式，用人工培养的菌丝在自然条件下的寄主根部诱导形成菌塘或菌落，最终发育成子实体。因此分离获得并培养松茸纯菌丝体对松茸的生产、研究具有十分重要的意义。目前公认的分离松茸菌丝体最佳的方法是利用子实体的菌褶部位，但这种分离方法依然存在着一些问题，如利用菌褶分离成功率依然不理想、易污染、菌丝在培养基上生长速度极其缓慢，难以迅速扩增等。
【发明内容】
[0004]针对上述现有技术的不足，本发明提供的是一种高效分离松茸菌种的方法，采用本方法使得菌丝萌发快，长势强。
[0005]本发明所采用的技术如下:一种高效分离松茸菌种的方法，如下:挑选松茸子实体时选择外观典型、大小适中、菌肉肥厚、颜色正常且尚未开伞的子实体，将松茸子实体用质量浓度75%酒精棉擦洗2-3次，放入已灭菌的超净工作台中；将松茸子实体沿菌盖与菌柄交界处掰开，再将菌盖表面表皮连同菌幕撕下，露出无菌的菌肉与菌褶部分；用无菌镊子夹住菌盖边缘，夹取l-2cm3大小的组织块，夹取的组织块既包括上层的菌肉又包括下层的菌褶部分；此时平板培养基温度在60°C左右，尚未凝固，用组织块的菌肉部分蘸取少量未凝固培养基，菌褶部分不与培养基接触，将组织块粘于培养皿盖内表面正中间，菌褶部分向下，组织块与培养基距离0.6cm ;盖上盖封口保存，在25°C黑暗条件下正置培养，组织块的菌肉部分向菌褶供给营养，使菌褶成熟并喷洒孢子，成熟的孢子喷洒至培养基上萌发成纯菌丝体。
[0006]本发明还具有如下技术特征:
[0007]所述的培养基配方为:
[0008]桑黄菌丝体6d发酵液200ml/L，马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂14g/L，维生素A 1.5mg/L、维生素 B1 2.5mg/L 和维生素 B2 2.5mg/L ；
[0009]所述的桑黄菌丝体6d发酵液:在300ml PD液体培养基中接入桑黄斜面种，斜面种培养基为PDA，25°C避光培养7d，25°C振荡培养，160r/min，培养6d后，过滤得到发酵液；桑黄菌种来源于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏号:桑黄DLlOl CCTCC M 2011137。
[0010]本发明具有如下技术特点:
[0011]1、使用本发明分离松茸菌种的成功率高达90%以上，且操作简单易行，所需材料少；
[0012]2、孢子分离使用的是松茸的成熟孢子，具备双亲的遗传特性，生命力强，培育出的菌种质量好，优于一般的组织分离；
[0013]3、该分离方法中，组织块不与培养基直接接触，避免了一些杂菌污染，大大降低了污染率。
[0014]4、使用本发明中的培养基培养松茸孢子，萌发率高，菌丝粗壮，生长速度快，形成明显的气生菌丝。
【具体实施方式】
[0015]下面举例对本发明做进一步说明:
[0016]实施例1
[0017]一、培养基配方:
[0018]桑黄菌丝体6d发酵液200ml/L，PDA:马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂14g/L，维生素 Al.5mg/L、维生素 B1 2.5mg/L、维生素 B2 2.5mg/L。
[0019]具体操作方法，IL培养基为例:马铃薯去皮，称取200g，切成大约Icm3的小块，加水500ml，煮沸后维持沸腾20min，过滤得滤液。将滤液与200ml桑黄菌丝发酵液混合，加入维生素Al.5mg、维生素B1 2.5mg、维生素B2 2.5mg，加热搅拌至完全溶解，定容到100ml0分装到三角瓶中，高压蒸汽灭菌121°C，0.105MPa，20min。
[0020]桑黄菌丝体6d发酵液:在300ml PD液体培养基中O3D培养基成分:马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L)接入一试管桑黄斜面种(斜面种培养基为PDA，25°C避光培养7d)，25°C振荡培养，160r/min，培养6d后，过滤得到发酵液。桑黄菌种来源于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏号:桑黄 DLlOl CCTCC M 2011137。
[0021]二、倒平板:
[0022]将培养基与培养皿(d = 90mm)用高压灭菌锅121°C灭菌20min后，放入超净工作台中，紫外消毒30min后倒平板，在酒精灯火焰附近操作，每个培养皿倒25-30ml培养基，在培养基尚未凝固时使用。
[0023]实施例2
[0024]—种高效分离松茸菌种的方法，如下:
[0025]步骤一:种菇选取及表面消毒
[0026]挑选松茸子实体时应选择外观典型、大小适中、菌肉肥厚、颜色正常且尚未开伞的子实体。将松茸子实体用75%酒精棉擦洗2-3次，放入已灭菌的超净工作台中。
[0027]步骤二:切块接种
[0028]将松鸾子实体沿菌盖与菌柄交界处掰开，再将菌盖表面表皮连同菌幕撕下，露出无菌的菌肉与菌褶部分。用无菌镊子夹住菌盖边缘，夹取l-2cm3大小的组织块，夹取的组织块既包括上层的菌肉又包括下层的菌褶部分。此时平板培养基温度在60°C左右，尚未凝固。用组织块菌肉部分蘸取少量未凝固培养基(菌褶部分不可与培养基接触)，将组织块粘于培养皿盖内表面正中间，菌褶部分向下，组织块与培养基距离约0.6cm。盖上盖封口保存。
[0029]步骤三:培养纯化
[0030]在25°C黑暗条件下正置培养，组织块的菌肉部分可以向菌褶供给营养，使菌褶成熟并喷洒孢子。成熟的孢子喷洒至培养基上即可萌发成纯菌丝体。
【主权项】
1.一种高效分离松茸菌种的方法，其特征在于，方法如下: 挑选松茸子实体时选择外观典型、大小适中、菌肉肥厚、颜色正常且尚未开伞的子实体，将松茸子实体用质量浓度75%酒精棉擦洗2-3次，放入已灭菌的超净工作台中；将松茸子实体沿菌盖与菌柄交界处掰开，再将菌盖表面表皮连同菌幕撕下，露出无菌的菌肉与菌褶部分；用无菌镊子夹住菌盖边缘，夹取l-2cm3大小的组织块，夹取的组织块既包括上层的菌肉又包括下层的菌褶部分；此时平板培养基温度在60°C左右，尚未凝固，用组织块的菌肉部分蘸取少量未凝固培养基，菌褶部分不与培养基接触，将组织块粘于培养皿盖内表面正中间，菌褶部分向下，组织块与培养基距离0.6cm ;盖上盖封口保存，在25°C黑暗条件下正置培养，组织块的菌肉部分向菌褶供给营养，使菌褶成熟并喷洒孢子，成熟的孢子喷洒至培养基上萌发成纯菌丝体。2.如权利要求1所述的一种高效分离松茸菌种的方法，其特征在于，所述的培养基配方为: 桑黄菌丝体6d发酵液200ml/L，马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂14g/L，维生素Al.5mg/L、维生素 BJ.5mg/L 和维生素 B22.5mg/L ； 所述的桑黄菌丝体6d发酵液:在300ml H)液体培养基中接入桑黄斜面种，斜面种培养基为PDA，25°C避光培养7d，25°C振荡培养，160r/min，培养6d后，过滤得到发酵液；桑黄菌种来源于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏号:桑黄DLlOl CCTCC M 2011137。
【专利摘要】本发明提供了一种高效分离松茸菌种的方法，方法是利用松茸的孢子分离，夹取松茸的组织块，组织块既包含菌褶又包含菌肉部分，粘于培养皿盖内表面正中间，菌褶部分向下，成熟后的菌褶可以喷洒大量孢子，松茸孢子落到培养基上即可萌发成纯菌丝体。利用该方法及培养基分离松茸菌种的成功率高达90％以上，且操作简单易行，所需材料少；组织块与培养基没有直接接触，避免了一些杂菌污染，大大降低了污染率；使用本发明中的培养基培养松茸孢子，萌发率高，菌丝粗壮，生长速度快，形成明显的气生菌丝。本发明可以解决目前松茸利用菌褶分离成功率不理想、易污染、菌丝在培养基上生长速度极其缓慢，难以迅速扩增等问题。
【IPC分类】C12N1/14, A01G1/04
【公开号】CN105132289
【申请号】CN201510425357
【发明人】邹莉, 王世新, 孙婷婷, 崔嵘, 张国权, 李晶莹, 张健
【申请人】东北林业大学
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年7月17日