一种降解柚皮苷的菌种及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种叶杆菌，尤其是涉及其降解柚皮苷的方法。
【背景技术】
[0002] 柚皮苷（Naringenine-7-rhamnosidoglucoside)，又名柚戒、柑橘戒、异橙皮戒，是 蜜柚果皮中最主要的苦味物质。减少柚皮苷的含量，建立蜜柚果汁脱苦的产业化技术将给 饮料工业带来重大的进步。近年来，微生物降解柚皮苷的方法越来越引起人们的重视，涉及 微生物的种类有真菌，细菌和酵母等，其中真菌生产柚苷酶来降解柚皮苷已经取得一定的 成果；而细菌降解柚皮苷的研究还较少。
[0003] 随着蜜柚种植面积不断扩大，蜜柚产量逐年上升，每年单是福建省的蜜柚产值就 达到6000万吨，但是由于深加工技术研究滞后，尚未实现产业化的深加工，产供销矛盾日 益突出，导致大量的果实被丢弃，丢弃果实腐烂的恶臭气味又严重污染了环境。蜜柚榨汁是 蜜柚深加工的主要手段，但是获得的鲜果汁具有明显的苦味，需要除去柚皮苷，进行脱苦处 理后才能饮用。因此，如何有效降解柚皮苷成为一个紧迫的课题。
[0004] 目前蜜柚汁脱苦的主要方法有物理吸附法，食品添加剂方法和生物酶制剂等方 法。物理吸附法在吸附苦味物质的同时，也将吸附果汁中的营养成分，食品添加剂法只是 将苦味物质掩蔽，并没有将其除去；而生物酶制剂法，中国专利201010219099. 6 (公开号 CN101897452A，公开时间2010年12月1日）公开了一种蜜柚果汁脱苦酶的发酵生产方法， 该方法需要对酶进行分离纯化，此过程的成本较高。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种降解柚皮苷的菌种叶杆菌（Phyllobacteriumsp.) Wb51b〇
[0006] 所述菌种为叶杆菌（Phyllobacteriumsp. )Wb51b，从土壤样品中筛选得到，已于 2012年保藏于中国普通微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所），该保藏中心登记入册编号为 CGMCCNo. 6472。
[0007] 本发明的另一个目的在于提供一种降解柚皮苷的方法。
[0008] 该方法利用叶杆菌（Phyllobacteriumsp.)降解柚皮苷。具体步骤包括：将叶杆 菌（Phyllobacteriumsp.)接种入含有柚皮苷的培养基，进行培养，并使用所培养的游离细 胞、进行固定化后的细胞或其混合形态，来降解柚皮苷。
[0009] 本发明采用上述馆藏号为CGMCCNo.6472的叶杆菌降解柚皮苷。
[0010] 所述进行培养的初始pH值为3. 5~8. 5,优选3. 5~6. 5,更优选3. 0~5. 0。
[0011] 所述培养时间12小时~7天，优选24h~72h，更优选48h~72h。
[0012] 所述培养温度优选25~50 °C，优选25~35 °C，更优选30~35 °C。
[0013] 可利用海藻酸钠对细胞进行固定化。
[0014] 可重复利用固定化细胞降解柚皮苷。
[0015] 本发明的突出优点在于：
[0016] 1.本发明所用菌种为细菌，能够高效降解柚皮苷，对营养要求简单、易培养。
[0017] 2.本发明所用菌种无致病性，无生物安全性方面的隐患，可以直接应用于食品工 业，使用游离细胞降解柚皮苷，无需对相关的酶进行分离纯化，可以降低成本。
[0018] 3.本发明可以使用海藻酸钠固定化细胞来降解柚皮苷，可以多次重复利用。
【具体实施方式】
[0019] 本发明提供一种可降解柚皮苷的叶杆菌。
[0020] 本发明公开一种利用叶杆菌降解柚皮苷的方法。
[0021] 所述降解柚皮苷的具体步骤为：
[0022] 将叶杆菌（Phyllobacteriumsp.)CGMCCNo. 6472接种入含有柚皮苷的培养基中 进行培养，使用所培养的游离细胞或细胞进行固定化后降解柚皮苷，培养过程中测定其生 长情况和柚皮苷的降解情况。
[0023] 所述含有柚皮苷的培养基中，包含以下组分：柚皮苷、硫酸铵、磷酸氢二钾、硫酸 镁、氯化钙。上述各组分的含量优选以下组合：柚皮苷含量〇. 1~50g/L，硫酸铵0. 05~2g/ L，磷酸氢二钾0. 05~2g/L，硫酸镁0. 05~2g/L，氯化钙0. 05~2g/L。其中，柚皮苷含量 优选0. 1~5g/L，更优选0. 1~2g/L。
[0024] 所述进行培养的初始pH值为3. 5~8. 5,优选pH指为3. 5~6. 5,更优选3. 0~ 5. 0〇
[0025] 所述培养时间没有特别限定，优选24h~72h，更优选48h~72h。培养时间太短， 则降解不够彻底；培养时间太长，不经济。
[0026] 所述培养温度没有特别限定，优选25~35°C，更优选30~35°C。培养温度高，菌 体生长快，太高菌体会死亡，培养温度低，菌体生长慢，太低菌体会死亡。
[0027] 所述方法可使用游离细胞降解柚皮苷。
[0028] 所述方法可使用固定化后的细胞降解柚皮苷。可使用的固定化材料没有特别限 制，只要可实现对细胞的固定即可。
[0029]可重复利用固定化细胞降解柚皮苷。
[0030] 还可利用游离细胞和固定化细胞的混合形式降解柚皮苷。所述混合的比例和方法 没有特别限制。
[0031] 在发酵培养过程中，可测定叶杆菌的生长情况和柚皮苷的降解情况。
[0032] 下面结合一些具体实施例做进一步描述。具体实施例为进一步详细说明本发明， 非限定本发明的保护范围。
[0033] 实施例1
[0034] (1)菌种的分离和纯化
[0035] 取蜜柚果园新鲜土壤样品lg加入到100mL的富集培养基中培养48h，取lmL富集 培养液转入新的富集培养基中，连续富集培养3代。取富集培养液lmL，以10倍梯度进行 连续的稀释，选择合适稀释度的菌悬液〇.2mL，于分离培养基中涂布，置于 30°C培养箱中培养72h后，挑取所有生长的菌株分别进行划线分离培养。连续划线分离培 养3代，获得纯化菌株。将这些纯菌株转移至液体培养基，30°C，150rpm，摇床培养，培养72h之后，按下述方法测定柚皮苷含量的变化情况：
[0036] 采用高效液相色谱法进行测定，条件为：流动相：乙腈：水=25 : 75 ;分析柱为： C18反相色谱柱；温度：34°C;进样量：20μL;流速：1.OmL/min;仪器为：安捷伦1200LC。
[0037] 菌株的分离和纯化过程中所用培养基组成如下：
[0038] 富集培养基、分离培养基、液体培养基（g/L):柚皮苷2 ;硫酸铵1 ;磷酸氢二钾1 ; 无水氯化钙0. 2 ;硫酸镁0. 5 ;pH4. 0~5. 0 ;0.IMPa灭菌20min。
[0039] (2)菌株鉴定
[0040] 将筛选得到的菌株Wb51b进行形态特征和16SrDNA序列鉴定，具体过程如下：
[0041] 菌株Wb51b为革兰氏阴性杆菌，菌落边缘呈白色，不规则星形；中部颜色较深，为 土黄色，圆形；中心呈橙黄色。菌落表面光滑且较湿润，菌体容易挑离。
[0042] 菌株Wb51b的16SrDNA核苷酸序列如序列表所示。
[0043] 其与模式菌株Phyllobacteriumsp.的同源性最高，达到99. 92%。
[0044] 基于以上特征将步骤（1)筛选得到的菌株Wb51b鉴定为叶杆菌（Phyllobacterium sp. ) 〇
[0045] 实施例2
[0046] 生长曲线的测定及柚皮苷的降解。
[0047]菌种：Phyllobacteriumsp.Wb5lbCGMCCNo. 6472。
[0048] 培养基：
[0049] 种子培养基（g/L):葡萄糖1 ;酵母粉2 ;蛋白胨0. 5 ;柚皮苷0.