一种长期保存蛹虫草菌种的方法
【专利摘要】本发明涉及菌种保存【技术领域】，具体涉及一种长期保存蛹虫草菌种的方法，包括如下步骤：A、菌种培养：在无菌条件下，将蛹虫草健康菌种接种到灭菌好的PDA斜面培养基上，进行暗培养，待菌丝长满斜面40%-60%后，进行光培养；B、培养基脱水：将装有培养物的试管放入干燥皿，再将干燥皿置于冰箱中，待斜面培养基脱水至体积剩下20%-30%时，取出试管；C、菌种保存：往试管中缓慢注入灭菌好的石蜡油至淹没培养物1cm以上，震荡去除培养物表面气泡，塞入灭菌好的脱脂棉花，用灭菌好的石蜡封口后加盖灭菌好的pp薄膜，垂直摆放于0℃冰箱保存。本发明能更好地抑制菌种的生理活动，菌种能保存3年以上，且保存后的菌种活力依然较好。
【专利说明】一种长期保存蛹虫草菌种的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及菌种保存【技术领域】，具体涉及一种长期保存蛹虫草菌种的方法。
【背景技术】
[0002]现有的石蜡保存法的一般步骤为:将液体石蜡灭菌，放于37°C恒温箱中，使水汽蒸发掉备用。再将已分纯的待存菌在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体，用无菌吸管吸取已灭菌的液体石蜡，注入已长好的斜面培养基上，用量以高出斜面Icm为准，将试管直立，贴上标签，置4°C下保存。该方法制作简单，不需要特殊设备，菌种可以保存I年左右不需要经常移种，缺点是保存的时候需要直立放置。
[0003]但对于有些生命力顽强的菌种，如蛹虫草菌种，现有的石蜡保存法并不适用，因此，有必要研发一种能更好地抑制菌种的生理活动的长期保存方法。
【发明内容】
[0004]为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种长期保存蛹虫草菌种的方法，该方法能更好地抑制菌种的生理活动，相比现有的液体石蜡保存法，经本发明的方法保存的蛹虫草菌种能保存3年以上，且保存后的菌种活力依然较好。
[0005]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种长期保存蛹虫草菌种的方法，包括如下步骤:
A、菌种培养:在无菌条件下，将蛹虫草健康菌种接种到灭菌好的PDA斜面培养基上，进行暗培养，待菌丝长满斜面40%-60%后，进行光培养；
B、培养基脱水:将装有培养物的试管放入干燥皿，再将干燥皿置于冰箱中，待斜面培养基脱水至体积剩下20%-30%时，取出试管；
C、菌种保存:往试管中缓慢注入灭菌好的石蜡油至淹没培养物Icm以上，震荡去除培养物表面气泡，塞入灭菌好的脱脂棉花，用灭菌好的石蜡封口后加盖灭菌好的pp薄膜，垂直摆放于0°C冰箱保存。优选的，缓慢注入灭菌好的石蜡油至淹没培养物l-3cm。
[0006]本发明通过将菌丝长满斜面40%_60%后，再进行光培养，可以根据菌丝的生长速度来决定培养时间。本发明通过在石蜡封口后加盖灭菌好的PP薄膜，能保持试管口的卫生，防止污染。
[0007]优选的，所述步骤A之前还包括步骤A0、材料准备:将装有PDA斜面培养基的试管用4层报纸封口，灭菌前在试管的内外各加I层pp薄膜，高温高压灭菌后去掉外层的pp薄膜，在超净台上晾至常温，接种后去掉内层的PP薄膜；将脱脂棉花、石蜡和石蜡油灭菌备用。
[0008]本发明通过将装有PDA斜面培养基的试管用4层报纸封口，其透气性较好，方便后续培养基的脱水；本发明通过在试管的内外各加I层PP薄膜，能防止PDA斜面培养基在灭菌过程中破损；本发明通过在高温高压灭菌后去掉外层的PP薄膜，有利报纸上水分蒸发，保证干爽，减少污染。
[0009]优选的，所述步骤A中，暗培养的培养温度为24°C ±1°C，培养时间为2-3天。
[0010]所述暗培养在干爽环境下进行，能减少污染；本发明通过将暗培养的培养温度控制在24°C ±1°C，培养时间控制在2-3天，有利于菌丝的生长。
[0011]更为优选的，所述步骤A中，暗培养的培养温度为24°C，培养时间为2天。
[0012]优选的，所述步骤A中，光培养的培养温度为24°C ±1°C，光照强度为400-6001ux，培养时间为1-2天。
[0013]本发明通过将光照强度控制在400-6001UX，有利于分生孢子的生长；本发明通过将培养时间控制在1-2天，分生孢子数量多，质量好。
[0014]更为优选的，所述步骤A中，光培养的培养温度为24°C，光照强度为5001ux，培养时间为I天。
[0015]上述一种长期保存蛹虫草菌种的方法得到的蛹虫草菌种，所述蛹虫草菌种的保存时间为3-4年。
[0016]本发明的有益效果在于:本发明的方法采用培养基脱水步骤，能抑制菌种的生理活性，并配合低温保存，进一步抑制菌种的生理代谢，延长保存时间。本发明的方法能更好地抑制菌种的生理活动，相比现有的液体石蜡保存法，经本发明的方法保存的蛹虫草菌种能保存3年以上，且保存后的菌种活力依然较好。
[0017]蛹虫草人工培养中，出发菌种的质量是决定子实体有效成分含量高低的关键因素，但蛹虫草优良菌种在繁殖过程中，退化是难以避免的。因此，筛选获得优良菌种之后，将之有效保存，并在必要的时候复活，最大程度发挥菌种的生产性能，将有利于保证优良菌种的供应，促进人工栽培蛹虫草的规模化和产业化发展。
【具体实施方式】
[0018]为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
[0019]实施例1
一种长期保存蛹虫草菌种的方法，包括如下步骤:
A、菌种培养:在无菌条件下，将蛹虫草健康菌种接种到灭菌好的PDA斜面培养基上，进行暗培养，待菌丝长满斜面40%后，进行光培养；
B、培养基脱水:将装有培养物的试管放入干燥皿，再将干燥皿置于冰箱中，待斜面培养基脱水至体积剩下20%时，取出试管；
C、菌种保存:在超净工作台上往试管中缓慢注入灭菌好的石蜡油至淹没培养物1cm，用小型漩涡振荡器去除培养物表面气泡，塞入灭菌好的脱脂棉花，用灭菌好的石蜡封口后加盖灭菌好的PP薄膜，垂直摆放于0°C冰箱保存。
[0020]所述步骤A之前还包括步骤A0、材料准备:将装有PDA斜面培养基的试管用4层报纸封口，灭菌前在试管的内外各加I层pp薄膜，高温高压灭菌后去掉外层的pp薄膜，在超净台上晾至常温，接种后去掉内层的PP薄膜；将脱脂棉花、石蜡和石蜡油灭菌备用。
[0021]所述步骤A中，暗培养的培养温度为23°C，干爽环境下培养2天。
[0022]所述步骤A中，光培养的培养温度为23°C，光照强度为4001ux，培养时间为2天。
[0023]上述一种长期保存蛹虫草菌种的方法得到的蛹虫草菌种，所述蛹虫草菌种的保存时间为3年。
[0024]实施例2
一种长期保存蛹虫草菌种的方法，包括如下步骤:
A、菌种培养:在无菌条件下，将蛹虫草健康菌种接种到灭菌好的PDA斜面培养基上，进行暗培养，待菌丝长满斜面45%后，进行光培养；
B、培养基脱水:将装有培养物的试管放入干燥皿，再将干燥皿置于冰箱中，待斜面培养基脱水至体积剩下22%时，取出试管；
C、菌种保存:在超净工作台上往试管中缓慢注入灭菌好的石蜡油至淹没培养物
1.5cm，用小型漩涡振荡器去除培养物表面气泡，塞入灭菌好的脱脂棉花，用灭菌好的石蜡封口后加盖灭菌好的PP薄膜，垂直摆放于0°C冰箱保存。
[0025]所述步骤A之前还包括步骤A0、材料准备:将装有PDA斜面培养基的试管用4层报纸封口，灭菌前在试管的内外各加I层pp薄膜，高温高压灭菌后去掉外层的pp薄膜，在超净台上晾至常温，接种后去掉内层的PP薄膜；将脱脂棉花、石蜡和石蜡油灭菌备用。
[0026]所述步骤A中，暗培养的培养温度为24°C，干爽环境下培养3天。
[0027]所述步骤A中，光培养的培养温度为23°C，光照强度为4501ux，培养时间为I天。
[0028]上述一种长期保存蛹虫草菌种的方法得到的蛹虫草菌种，所述蛹虫草菌种的保存时间为3.5年。
[0029]实施例3
一种长期保存蛹虫草菌种的方法，包括如下步骤:
A、菌种培养:在无菌条件下，将蛹虫草健康菌种接种到灭菌好的PDA斜面培养基上，进行暗培养，待菌丝长满斜面50%后，进行光培养；
B、培养基脱水:将装有培养物的试管放入干燥皿，再将干燥皿置于冰箱中，待斜面培养基脱水至体积剩下25%时，取出试管；
C、菌种保存:在超净工作台上往试管中缓慢注入灭菌好的石蜡油至淹没培养物2cm，用小型漩涡振荡器去除培养物表面气泡，塞入灭菌好的脱脂棉花，用灭菌好的石蜡封口后加盖灭菌好的PP薄膜，垂直摆放于0°C冰箱保存。
[0030]所述步骤A之前还包括步骤A0、材料准备:将装有PDA斜面培养基的试管用4层报纸封口，灭菌前在试管的内外各加I层pp薄膜，高温高压灭菌后去掉外层的pp薄膜，在超净台上晾至常温，接种后去掉内层的PP薄膜；将脱脂棉花、石蜡和石蜡油灭菌备用。
[0031]所述步骤A中，暗培养的培养温度为24°C，干爽环境下培养2天。
[0032]所述步骤A中，光培养的培养温度为24°C，光照强度为5001ux，培养时间为I天。
[0033]上述一种长期保存蛹虫草菌种的方法得到的蛹虫草菌种，所述蛹虫草菌种的保存时间为4年。
[0034]实施例4
一种长期保存蛹虫草菌种的方法，包括如下步骤:
A、菌种培养:在无菌条件下，将蛹虫草健康菌种接种到灭菌好的PDA斜面培养基上，进行暗培养，待菌丝长满斜面55%后，进行光培养；
B、培养基脱水:将装有培养物的试管放入干燥皿，再将干燥皿置于冰箱中，待斜面培养基脱水至体积剩下28%时，取出试管； C、菌种保存:在超净工作台上往试管中缓慢注入灭菌好的石蜡油至淹没培养物
2.5cm，用小型漩涡振荡器去除培养物表面气泡，塞入灭菌好的脱脂棉花，用灭菌好的石蜡封口后加盖灭菌好的PP薄膜，垂直摆放于0°C冰箱保存。
[0035]所述步骤A之前还包括步骤A0、材料准备:将装有PDA斜面培养基的试管用4层报纸封口，灭菌前在试管的内外各加I层pp薄膜，高温高压灭菌后去掉外层的pp薄膜，在超净台上晾至常温，接种后去掉内层的PP薄膜；将脱脂棉花、石蜡和石蜡油灭菌备用。
[0036]所述步骤A中，暗培养的培养温度为23°C，干爽环境下培养3天。
[0037]所述步骤A中，光培养的培养温度为24°C，光照强度为5501ux，培养时间为2天。
[0038]上述一种长期保存蛹虫草菌种的方法得到的蛹虫草菌种，所述蛹虫草菌种的保存时间为3.5年。
[0039]实施例5
一种长期保存蛹虫草菌种的方法，包括如下步骤:
A、菌种培养:在无菌条件下，将蛹虫草健康菌种接种到灭菌好的PDA斜面培养基上，进行暗培养，待菌丝长满斜面60%后，进行光培养；
B、培养基脱水:将装有培养物的试管放入干燥皿，再将干燥皿置于冰箱中，待斜面培养基脱水至体积剩下30%时，取出试管；
C、菌种保存:在超净工作台上往试管中缓慢注入灭菌好的石蜡油至淹没培养物3cm，用小型漩涡振荡器去除培养物表面气泡，塞入灭菌好的脱脂棉花，用灭菌好的石蜡封口后加盖灭菌好的PP薄膜，垂直摆放于0°C冰箱保存。
[0040]所述步骤A之前还包括步骤A0、材料准备:将装有PDA斜面培养基的试管用4层报纸封口，灭菌前在试管的内外各加I层pp薄膜，高温高压灭菌后去掉外层的pp薄膜，在超净台上晾至常温，接种后去掉内层的PP薄膜；将脱脂棉花、石蜡和石蜡油灭菌备用。
[0041]所述步骤A中，暗培养的培养温度为25°C，干爽环境下培养2天。
[0042]所述步骤A中，光培养的培养温度为25°C，光照强度为6001ux，培养时间为I天。
[0043]上述一种长期保存蛹虫草菌种的方法得到的蛹虫草菌种，所述蛹虫草菌种的保存时间为3年。
[0044]本发明的方法采用培养基脱水步骤，能抑制菌种的生理活性，并配合低温保存，进一步抑制菌种的生理代谢，延长保存时间。本发明的方法能更好地抑制菌种的生理活动，相比现有的液体石蜡保存法，经本发明的方法保存的蛹虫草菌种能保存3年以上，且保存后的菌种活力依然较好。
[0045]上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种长期保存蛹虫草菌种的方法，其特征在于:包括如下步骤: A、菌种培养:在无菌条件下，将蛹虫草健康菌种接种到灭菌好的PDA斜面培养基上，进行暗培养，待菌丝长满斜面40%-60%后，进行光培养； B、培养基脱水:将装有培养物的试管放入干燥皿，再将干燥皿置于冰箱中，待斜面培养基脱水至体积剩下20%-30%时，取出试管； C、菌种保存:往试管中缓慢注入灭菌好的石蜡油至淹没培养物Icm以上，震荡去除培养物表面气泡，塞入灭菌好的脱脂棉花，用灭菌好的石蜡封口后加盖灭菌好的pp薄膜，垂直摆放于O °C冰箱保存。
2.根据权利要求1所述的一种长期保存蛹虫草菌种的方法，其特征在于:所述步骤A之前还包括步骤A0、材料准备:将装有PDA斜面培养基的试管用4层报纸封口，灭菌前在试管的内外各加I层PP薄膜，高温高压灭菌后去掉外层的PP薄膜，在超净台上瞭至常温，接种后去掉内层的PP薄膜；将脱脂棉花、石蜡和石蜡油灭菌备用。
3.根据权利要求1所述的一种长期保存蛹虫草菌种的方法，其特征在于:所述步骤A中，暗培养的培养温度为24°C ± I °C，培养时间为2-3天。
4.根据权利要求1所述的一种长期保存蛹虫草菌种的方法，其特征在于:所述步骤A中，暗培养的培养温度为24°C，培养时间为2天。
5.根据权利要求1所述的一种长期保存蛹虫草菌种的方法，其特征在于:所述步骤A中，光培养的培养温度为24°C ±1°C，光照强度为400-6001ux，培养时间为1_2天。
6.根据权利要求1所述的一种长期保存蛹虫草菌种的方法，其特征在于:所述步骤A中，光培养的培养温度为24°C，光照强度为5001ux，培养时间为I天。
7.如权利要求1-6任一项所述的一种长期保存蛹虫草菌种的方法得到的蛹虫草菌种，其特征在于:所述蛹虫草菌种的保存时间为3-4年。
【文档编号】C12N1/04GK104450521SQ201410800709
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月22日 优先权日:2014年12月22日
【发明者】郑贵朝, 叶锦泉, 喻孟君 申请人:东莞市生物技术研究所