花生四烯酸的制备方法
【专利摘要】花生四烯酸的制备方法，涉及花生四烯酸。对高山被孢霉产ARA的培养条件进行优化，在基础培养基分批发酵，在优化培养基中以酵母粉和玉米浆为氮源分批发酵，再以酵母粉为氮源进行的发酵罐放大实验，对高山被孢霉在优化培养基中以玉米浆和酵母粉为混合氮源进行培养，将优化培养基中的氮源替换为玉米浆和酵母粉，得混合氮源优化培养基；对高山被孢霉在混合氮源优化培养基中分批发酵；对高山被孢霉高糖驯化及对驯化后的菌种在混合氮源优化培养基中分批发酵，再以酵母粉为氮源进行的发酵罐放大实验，菌体生长正常，未发生自溶现象，并获得干菌体、油脂和ARA。
【专利说明】花生四烯酸的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及花生四烯酸，尤其是涉及花生四烯酸的制备方法。
【背景技术】
[0002] 花生四烯酸（Arachidonic Acid,简称ARA，即5,8,11，14-二十碳四烯酸）属于 ω-6系列长链多不饱和脂肪酸，由于人体内不具备相应的酶系统来合成特定的不饱和双 键，因此被认为是人体必需脂肪酸，是许多二十碳衍生物如前列腺素 E2(PGE2)、前列环素 (PGI2)、血栓烷 A2 (TXA2)、白三烯 Leukotirene B4 (LTB4)和 C4 (LTC4)的直接前体。ARA 还具 有调节体内多种离子通道作用，控制细胞膜的通透性，维持机体保水性等许多重要的生理 功能。同时研究表明，花生四烯酸对婴儿的大脑发育和视觉功能的完善有着极为重要的意 义，花生四烯酸对高血压、高血脂、糖尿病、病毒感染等疾病的预防与治疗也有显著的效果 (Roger et al. Biotechnology Bioengineering，2010, 9 (20): 245-257)。因此，花生四烯酸 既是一种营养强化剂，又是人类重要的保健品。ARA作为人体必需脂肪酸发挥着无可替代的 作用，应用前景广阔。
[0003] ARA主要来源有植物、动物组织、鱼油以及微生物和微藻类等，但ARA在动物组织 中含量低，来源也有限，而微生物发酵法则为生产ARA开辟了新途径，它具有不受原材料及 气候限制、生长周期短、培养工艺简单、ARA含量高等特点，近年来已成为国内外研究的热 点。国际上开展产多不饱和脂肪酸（PFUAs)的微生物研究主要集中在以下几个方面：（1)产 PFUAs菌种的分离与选育；（2)培养条件及发酵工艺的优化；（3)培养方式的研究（包括批 式、补料、连续培养工艺等）；(4)PFUAs的分离纯化及结构鉴定。目前，人们仅发现接合菌纲 是比较具有研究价值的的一个纲，而且普遍看好被孢霉，认为它是生产ARA、EPA、DHA最有 潜力的菌种。目前，日本、美国等国家已经先后问世了 ARA的发酵产品，国内在这一领域的 研究起步晚，虽对微生物发酵生产ARA方面作了一些研究，但还存在着生物量偏低，油脂含 量较低等问题，离大规模的工业化生产仍有一定的距离。
[0004] 中国专利CN101613724公开一种利用高山被孢霉菌丝体制备花生四烯酸的方法， 包括有下述步骤：首先在恒温摇床中将高山被孢霉接种量的深层培养；再转接于装有发酵 培养基的器皿中，培养后获得发酵醪液，其中生长培养基或/和发酵培养基的氮源以高山 被孢霉菌柏代替部分常用氮源，高山被孢霉菌柏中的氮源替代比以质量百分比计为10%? 90% ;发酵醪液经过滤，收集的霉菌生物体，经洗涤、干燥、粉碎，采用非极性溶剂进行浸提 或压榨，收获油脂，收获的油脂经进一步处理获得目标产品，霉菌生物体经非极性溶剂浸提 后剩余固体物质，即为可循环使用的高山被孢霉菌柏，该发明利用高山被孢霉发酵生产花 生四烯酸过程中产生的废弃物得到循环利用，避免了环境污染物的排放。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供花生四烯酸的制备方法。
[0006] 本发明包括以下步骤：
[0007] 1)通过摇瓶实验对高山被孢霉产ARA的培养条件进行优化，所述优化的方法为 取4mL种子液接入装有50mL基础培养基（葡萄糖40g/L ;酵母粉5g/L ;MgS04-7H20 0. Ig/ L ;ΚΗ2Ρ040· 5g/L ;CaC030 . 05g/L ;ZnS04-7H20 0· lg/L ;ρΗ6· 0)的 250mL 三角瓶，28°C、150rpm 培养5?6d，得到优化培养基：葡萄糖60g/L ;酵母粉或玉米浆lOg/L ;谷氨酸I. Og/L ; MgS04-7H200. lg/L ;ΚΗ2Ρ042· Og/L ;CaC030 . 05g/L ;ZnS04-7H20 0· lg/L ;混合微量元素 lmL/L ; 混合维生素 lmL/L ;pH调至6. 0 ;
[0008] 2)对高山被孢霉在优化培养基中分别以酵母粉和玉米浆为氮源进行了 2L分批发 酵，再以酵母粉为氮源进行的发酵罐放大实验，菌体生长正常，未发生自溶现象，并获得干 菌体、油脂和ARA。
[0009] 在步骤1)中，所述混合微量元素可包括FeCl3 · 6H20,、H3B03、MnCl2 · 4H20、 CoCl2 · 6H20、CuSO4 · 5H20、NiSO4 · 6H20等；所述混合维生素可包括维生素 B12、生物素、维生 素 B1、泛酸钙等。
[0010] 在步骤2)中，所述发酵的条件可为：将培养3d的液体种子，按10%接种量接种于 基础培养基中，装液量I. 5L，初始葡萄糖浓度为60g/L，在28°C，搅拌转速200rpm，通气量 Ivvm ;所述干菌体可得21g/L,油脂可得9g/L, ARA可得3. 8g/L。 toon] 所述高山被孢霉可以接种适量的被孢霉至载有培养基的摇瓶中，置于摇床上培 养，转速为100?300rpm，较好的为150?200rpm。
[0012] 本发明涉及的培养基的组成成分，例如碳源、氮源可以有所不同。碳源可以使用 蔗糖、麦芽糖、糊精、淀粉等，葡萄糖是较适宜的碳源，来源简单，价格低廉，使用量为30? 80g/L。对于摇瓶种子培养，一般将使用量降低至10?30g/L，可根据培养的时间及所要求 的生物量密度来选择用量。具体合适的用量选择，本领域的技术人员可以通过相关操作确 定碳源的种类及合适用量。同时，可视微生物的生长情况，选择一次性加入全部碳源或者分 批补入。氮源可以选择酵母粉、玉米浆、蛋白胨、大豆粉等中的至少一种，酵母粉或者玉米浆 被认为是比较好的氮源，添加浓度在5?15g/L，本领域的技术人员可以通过相关实验操作 确定氮源的种类及用量。
[0013] 可选择使用单一氮源或混合氮源，更好的结果是使用混合氮源（玉米浆、酵母粉） 为发酵罐培养的适宜氮源，且二者的质量比例对于油脂的积累影响较大，可利用响应面分 析等统计方法进一步优化碳氮源的组合，较好的两种氮源比例为3:8 (w/w)。
[0014] 温度低于20°C高山被孢霉将会开始大量产生EPA，而培养要求得到较高含量的 ARA，同时尽量减低或避免产生EPA，培养温度通常保持在25?30°C。微生物发酵生产 PUFAs，其最高产量一般是在对数期后期或稳定期前期，因此要在最短的时间内获得最大可 能的生物量及总脂肪酸的含量，一般来说，最适收获ARA的时间是在第5?6天。
[0015] 真菌生长的pH范围较广，更偏好于在偏酸环境中生长，pH在4. 0至8. 0之间均可 以正常生长，本发明的实施过程中发现，初始pH 6. 0?6. 5,培养过程中pH在7?8之间有 利于ARA的积累；pH 4?5之间有利于生物量的积累，在培养过程中可分阶段的调节pH水 平以适应所要求的生长环境。
[0016] 接种量可以在2%至14% (V/V)，接种量低，生物量达不到所要求的水平，接种量 高，在生物量积累到一定程度将会抑制菌体的继续生长，在摇瓶培养中，接种控制在3 %? 5% (V/V)，而在发酵罐培养中，接种量控制在8%?10% (V/V)能得到较好的结果。
[0017] 培养基中碳氮比影响真菌油脂的积累，碳氮比在10 : 1至60 : 1之间，较好的是 40 : 1至50 : 1，在培养过程中可以选择灭菌前一次性加入或培养开始后分批加入。
[0018] 微生物的生长需要维生素等生长因子，当培养环境中缺乏维生素时，细胞内RNA、 DNA以及蛋白质的含量会下降。添加维生素 B1、维生素 B12、生物素及泛酸钙最有利于ARA的 积累，其用量分别在50?150mg/L、300?600μ g/L、400?600μ g/L及80?150mg/L之 间。谷氨酸可以提高细胞中G6TOH的活性，为被孢霉细胞的生长提供核酸原料，从而与花生 四烯酸的合成紧密相关，在培养基中添加〇. 5?2g/L的谷氨酸有利于ARA的积累。
[0019] 为了提高高山被孢霉的耗糖能力及保存过程中的稳定性，可对菌种进行了高糖驯 化培养，驯化后的结果发现，菌种的耗糖能力及产油能力明显提升，ARA的含量呈倍数增长。
[0020] 发酵培养过程可采用分批发酵或补料-分批发酵，分批发酵要求营养物质一次性 加入，营养物含量过高可能在培养前期抑制真菌的生长而延长延滞期，发酵周期随之延长， 而营养物含量过低，在培养后期无法满足真菌生长需要的营养补充。本领域的技术人员，可 以通过一系列实验操作确定适宜的碳氮营养物含量；补料-分批发酵培养过程中，必须对 培养液中的营养物质进行检测，特别是当葡萄糖浓度小于5g/L时，需要及时补充葡萄糖， 这是需要分别灭菌的。上述两种培养方式，在实施过程中，可能会出现起泡现象，这是不希 望出现的，可以选择在灭菌之间加入适量消泡剂或者在起泡现象出现时，适时地加入消泡 剂防止产生过量泡沫。
[0021] 根据上述优化高山被孢霉的发酵条件，能够获得较高的生物量及总油脂含量，可 以每12h或24h取样测定生物量、油脂及ARA含量，或者培养结束收获生物质测定。
[0022] 可以用多种方法对生物质体进行收获，例如过滤、真空抽滤、离心、膜分离、絮凝沉 淀等，一般的，选择成本低且方便操作的过滤或真空抽滤收获生物质体。收获后，可以选择 采用干菌体或湿菌体进行油脂的萃取，本实施过程中，对菌体进行干燥至含水量小于4%， 此时，使用丙酮、乙醇、异丙醇等醇类、烷烃如正己烷、正庚烷等萃取油脂是较适宜的，但正 己烷最佳。干燥后的菌体加入正己烷，进行研磨、匀浆或减法破壁萃取，得到的萃取液进行 离心分离取上层，蒸发除去其中的有机溶剂，得到总油脂即粗油。
[0023] 本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：原料易购、价格适中、培养基配制方 便、发酵工艺简便、花生四烯酸合成稳定、油脂产量为16?28g/L，其中花生四烯酸产量在 6. 5?16g/L，解决了花生四烯酸的发酵生产效率和产量低的问题、适合工业化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1为高山被孢霉在基础培养基中的发酵结果。
[0025] 图2高山被孢霉在添加了维生素、氨基酸和微量元素的培养基中的发酵结果。
[0026] 图3高山被孢霉在实施例3培养基中添加了混合氮源的发酵结果。
[0027] 图4驯化后的高山被孢霉在实施例4中的培养基中的发酵结果。
[0028] 图1?4分别为实施例2?5中不同培养基对高山被孢霉的生物量、总油脂和 ARA产量的影响结果。在图1?4中，横坐标为培养时间（h)，左纵坐标为葡萄糖消耗情 况Glucose (，g/L)，右纵坐标分别为生物量Biomass (·，g/L)，总油脂Total fatty acid ( ★，g/L)和 ARA 产量（▲，g/L)。
【具体实施方式】
[0029] 以下实施例用于进一步说明本发明。
[0030] 实施例1.利用高山被孢霉生产ARA
[0031] 在一个250mL摇瓶中培养高山被孢霉，载液量为50mL的活化培养基，150rpm， 28°C，活化3天。再将活化后的菌株接入基础培养基，装液量250mL的摇瓶装入50mL的基 础培养基，接种量10% (v/v)，于28°C往复式摇床培养5?6d，转速150rpm，28°C，培养5d 后收获，抽滤收获生物质，将其恒温干燥至恒重，用正己烷研磨萃取油脂，蒸发除去有机容 剂后，得到总油脂5g/L。
[0032] 活化培养基组成（g/L):
[0033]
【权利要求】
1. 花生四烯酸的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 通过摇瓶实验对高山被孢霉产ARA的培养条件进行优化，所述优化的方法为取 4mL种子液接入装有50mL基础培养基的250mL三角瓶，28°C、150rpm培养5?6d，得到 优化培养基：葡萄糖60g/L ;酵母粉或玉米浆10g/L ;谷氨酸1. Og/L ;MgS04-7H200. lg/L ; KH2P042. Og/L ;CaC030. 05g/L ;ZnS04-7H20 0? lg/L ;混合微量元素 lmL/L ;混合维生素 lmL/ L ;pH调至6. 0 ;所述基础培养基的组成为葡萄糖40g/L ;酵母粉5g/L ;MgS04-7H20 0. lg/L ; KH2P040. 5g/L ；CaC030. 05g/L ；ZnS04-7H20 0. lg/L ；pH 6. 0 ； 2) 对高山被孢霉在优化培养基中分别以酵母粉和玉米浆为氮源进行了 2L分批发酵， 再以酵母粉为氮源进行的发酵罐放大实验，菌体生长正常，未发生自溶现象，并获得干菌 体、油脂和ARA。
2. 如权利要求1所述花生四烯酸的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述混合微量 元素包括 FeCl3 ? 6H20,、H3B03、MnCl2 ? 4H20、CoCl2 ? 6H20、CuS04 ? 5H20、NiS04 ? 6H20。
3. 如权利要求1所述花生四烯酸的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述混合维生 素包括维生素B12、生物素、维生素&、泛酸钙。
4. 如权利要求1所述花生四烯酸的制备方法，其特征在于在步骤2)中，所述发酵的条 件为：将培养3d的液体种子，按10 %接种量接种于基础培养基中，装液量1. 5L，初始葡萄糖 浓度为60g/L，在28°C，搅拌转速200rpm，通气量lvvm。
【文档编号】C12R1/645GK104388486SQ201410800324
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2013年9月13日 优先权日:2013年9月13日
【发明者】卢英华, 曾思钰, 凌雪萍, 敬科举, 吴意珣, 陈翠雪 申请人:厦门大学