专利名称：利用2-5A合成酶和RNase L基因提高水稻品种对水稻黑条矮缩病抗性的制作方法
技术领域：
本发明提供了一种利用2-5A合成酶和RNase L基因转化水稻获得对 水稻黑条矮缩病抗性提高的品种的新方法，属于农业生物技术领域。
背景技术：
水稻黑条矮缩病(Rice Mack-streaked dwarf virus, RBSDV)通过 灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen)以持久性方式传播的一种恶 性水稻病毒病，近年来在江苏等长江稻区发生流行危害。据统计，2007年 水稻黑条矮缩病仅在江苏省的建湖、兴化、盐都、灌南等地发生(发生危 害面积30.8万亩)，至2008年已迅速在淮北、沿海和里下河地区蔓延开， 全省发病面积上升至400万亩，其中仅病株率80%以上的绝收田块面积就 达3万亩，按平均亩产500公斤初步估算约损失稻谷1.5亿公斤，造成了 粮食减产、农民减收，给农业生产带来了巨大的损失，同时也严重挫伤了 农民的种粮积极性。由于迄今为止几乎没有能有效地从感染病毒的植株上 除去病毒的化学药剂，而治虫防病的应急防治措施也无法作为一项长期的 策略加以应用，这些原因进一步加大了病害的防治难度。水稻条紋叶枯病 的防治经验表明，利用品种自身的抗病性是防治病毒病最经济有效的措 施，可是生产上目前使用的品种对病害的抗性普遍较差，因此有必要发掘 和创制新的抗性资源，为水稻黑条矮缩病的可持续综合防控提供材料上的 储备。
植物抗病毒转基因工程策略是通过导入一些植物外源的抗病毒基因 来提高品种对病毒的抗性， 一般分为以病毒基因组介导的抗性、以动物干 扰素介导的抗性和以毒蛋白介导的抗性等几种。而其中以动物干扰素介导 的抗性由于具有广谱抗性和环境友好等特点备受关注。动物的干扰素
3(Interferon, INF)是动物细胞在病毒或其它诱生剂作用下产生的，具有 广谱抗病毒活性的蛋白质，其是目前所知的发挥作用最快的第一病毒防御 体系。目前已见报道的主要为2，-5，寡腺苷酸酶系统(2-5A系统)，该系统 在病毒dsRNA的作用下激活2-5A合成酶，产生一系列短的2'-5'寡腺苷酸 (2-5A), 2-5A再激活2-5A依赖性RNase L, RNase L进一步非特异的降解 mRNA，从而对高等脊推动物体内被侵染细胞内蛋白翻译产生抑制，并可引 发细胞凋亡，以达到限制病毒增殖的目的。Mitra将人类的2-5A系统的两 个酶以不同启动子驱动导入烟草中，发现转基因株对TMV、 AMV和TEV的
侵染均表现出了侵染部坏死现象。同时他还发现坏死现象仅局限于叶片部 分，而未延伸至这个植株，另外他还发现转基因植株上未接种病毒的叶片 没有被侵染，这表明2-5A系统在烟草中表达可以有效的提高植物对病毒 的抗性，并具有广谱抗性和特异性特点。Tmve则将2-5A系统导入土豆中 也获得了相类似的结果。由于2-5A系统来源于高等脊推动物，因此其与 病毒基因组发生互作的机会很小，这从一定程度上规避了转基因风险。但 目前为止，以2-5A系统转化水稻获得抗病毒转基因材料的研究未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用2-5A合成酶和RNase L基因转化水稻 获得对水稻黑条矮缩病抗性提高的品种的新方法。
本发明所提供的提高水稻品种对水稻黑条矮缩病抗性水平的方法，是 根据人类2'-5'寡腺苷酸酶系统的2-5A合成酶和RNase L可以响应于病毒 dsRNA，并通过降解病毒RNA来限制寄主体内病毒增殖的原理，将两基因 全长序列导入水稻中使之表达，进而提高转基因品种(系)对水稻黑条矮 缩病的抗性水平。
本发明所提供的能提高转基因受体品种(系)对水稻黑条矮缩病抗性 水平的方法，是通过以下方法验证的1) 从公共数据库获得2-5A合成酶和RNase L两基因全序列，将其分 别构建植物表达载体
2) 转化水稻品种获得转基因再生植株；
3 )通过PCR或Southern blot方法多代筛选获得的转基因双阳性水稻 品种(系)；
4 )通过RT-PCR或Northern blot方法确定转基因双阳性水稻品种(系) 中两基因是否正常转录；
5 )通过接种鉴定方法表明转基因双阳性水稻品种(系)对水稻黑条矮 缩病的抗性水平较转基因受体品种(系)有显著提高。
本发明提供了一种为水稻抗黑条矮缩病材料的创制提供新方法，其具 有以下优点①鉴于生产上缺乏抗病品种的现状，本方法可以为水稻黑条 矮缩病的可持续综合防控提供材料上的储备；②由于2-5A系统来源于高 等脊推动物，因此其与病毒基因组发生互作的机会很小，不易出现病毒异 源包被和重组的情况，较之病毒来源转基因策略本方法从一定程度上规避 了转基因风险。
图1为2-5A合成酶基因全序列获得方法示意图 图2为RNAse L基因全序列获得方法示意图 图3为2-5A合成酶基因植物表达载体构建示意图 图4为RNAse L基因植物表达载体构建示意图
图5为农杆菌介导转化水稻图(a为转化后愈伤组织开始分化；b为筛 选出新的小苗)
图6为T,代转2-5A系统基因水稻的PCR检测结果示意图(A为 基因检测结果；B为RNase L基因检测结果；M为天为时代Marker III; 1为植物转化载体扩增结果；2为非转基因对照扩增结果；3-10为L代转 2-5A基因水稻植株扩增结果)
图7为T,代转2-5A系统基因水稻的RT-PCR检测结果示意图(A为2-5A 基因检测结果；B为RNase L基因检测结果；M为天为时代Marker III; 1-4 为L代转基因植株扩增结果；CK为未转基因植株扩增结果)
具体实施例方式
下面实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。 实施例1、 2-5A合成酶和RNase L基因植物表达载体的获得 目的基因是来自于人类的2-5A系统的2-5A合成酶基因和RNAse L基 因，具体获得方式为在因特网上输入网址http:〃皿ncbi.nlm. nih. gov/nuccore/2379，进入图1页面，获得人类2-5A合成酶基因全序列； 在 因 特 网 上 输 入http: //www, ncbi. nlm. nih. gov/nuccore /485407 report-genbank网址，进入图2页面，获得人类RNase L基因(2-5A 依赖性RNase基因)全序列。获得的两基因长度分别为1.3 kb和2. 8kb, 分别编码364个和741个氨基酸。按照图3、 4构建植物载体pAMM2109和 pAMM2106,包括目的基因和选择标记两个表达单元。启动子大小为800bp， 来自花椰菜花叶病毒的35S启动子，启动目的基因组成性表达。终止子大 小为253bp的Nos3，序列，来自于Ti质粒中胭脂碱合成酶基因的终止序 列，起终止表达的作用。标记基因用nptll基因，大小为795bp来自于Kanr 细菌，编码产物APH (3， )-II氨基糖苷3 '-磷酸转移酶II,亦称新霉 素磷酸转移酶II，已证明无安全问题，是第一个安全使用的标记基因。载
体中没有使用报告基因。
实施例2、利用2-5A合成酶和RNase L基因植物表达载体转化水稻 将两个植物转化载体pAMM2109和pA匿2106以冻融法导入农杆菌EHA105，以粳稻品种盐粳21的幼胚愈伤组织作为转基因的受体材料进行 同时转化(图5)，水稻转化方法按Hiei等人的方法稍做改进。经抗生素 筛选获得8个T。代再生植株，移栽到坡璃温室均能正常生长、开花和结实， 故获得8个家系的L代种子。
实施例3、转基因后代的PCR筛选
根据2-5A和RNase L的序列设计特异性引物，其中2-5A为 5-TTCCTCAgTCC TCTCACCAC-3和5-gAgCTgCCTTCTCAggTACT-3，扩增片断大 小为630bp; RNase L为5— CCTCTGCATAACGCAGTA-3和5—GCTCCAGAAGC CTCTGCAC-3"扩增片断大小为590bp。釆用CTAB大量DNA提取方法提取 水稻DM (方法参照分子克隆实验指南，略)。PCR反应体系为lOng DNA 模板，0. 7ul Primer ( 4pmol/ul ), lul 10 x Buffer ( freeMgCh )， 0. 2ul dNTP (2.5mM)， 0.6ul MgCh(25mM), 0. lul Taq ( 5u/ul ), 6. 4ul ddH20。 PCR 反应程序为95。C变性5min; 95。C变性30s、 55-62。C退火30s、 72。C延 伸lmin，共进行35次循环72。C延伸7min。用0. 8 %的琼脂糖检测其扩增 产物，EB染色，凝胶成像系统拍照记录试验结果。
釆用PCR方法对L-T3代连续进行选择，对以盐粳21为受体的1个 L代转基因双阳性株的200个后代进行选择，获得17个双阳性T2代株， 2-5A和RNaseL两对引物从转基因阳性株中分别扩增出630bp和590bp的 带；选择10个T2代播种8株进行鉴定，PCR鉴定筛选获得27个双阳性T3 代株，但来源于同一L代的T3代株系没有全表现为双阳性的株系；对其中 的编号为4的T3代转基因株的8个后代进行鉴定，发现8株均表现为双阳 性(图6 )。从8株中选择4株4-2、 4-4、 4-5和4-6的后代各20个株系
进一步鉴定发现，其后代亦均表现为双阳性。
实施例4、 2-5A系统转基因水稻植株的转录检测
采用TRIzol法提取水稻总RNA对4-5等4个1代转基因双阳性株进行RT-PCR,取水稻叶片组织O. lg,加入lmLTRIzol reagent充分研磨， 室温放置5min;加入氯仿200 |aL，充分震荡15sec,室温放置3min; 12，000g, 4。C离心15min;取上层水相加入另 一离心管中，加入0. 5mL异 丙醇；12，000g， 4'C，离心10min (可见RNA沉淀)，弃去上清；加入lmL 70%乙醇(涡漩，7， OOOg离心5 min);干燥RNA沉淀，加ddH20 40 jaL 溶解即可。取一Eppendorf管，加入各样品RNA 3 jliL, 3、-端引物1 jaL, D.D.W6 juL,置于70。C下变性5 min,立即取出置于冰上放置5 min。再 依次加入下列试剂2 pL5xM-MuLV反转录酶缓冲液、0.5 jnL40mmol/L dNTPs (每种10隨ol/L)、 0.5 L RNasin (權/y L )、 0.5 yL M-MuLV 反转录酶(20U/|iL)和1. 5 jaL加入DEPC处理过的D.D.W。 42 。C水洛1 h, 7(TC灭活10min, -2(TC保存备用。再按上一步程序进行PCR,结果显 示2-5A和RNase L两对引物从4个转基因双阳性株中分别扩增出630bp 和590bp的带，表明在4个转基因双阳性株中2-5A和RNase L两基因均 能正常转录(图7)。
实施例5、 2-5A系统转基因水稻株系对水稻黑条矮缩病的抗性表现 水稻黑条矮缩病接种鉴定方法参照阮义理等稍做改进，鉴定4个以盐 粳21为受体的转基因株系的抗性表现，试验预设水稻黑条矮缩病感病对 照华粳6号及受体对照盐粳21。从田间釆集水稻黑条矮缩病感病植株，选 用1龄左右的无毒虫取食感病水稻，饲毒4天，再经过15天左右的循徊 期，以ELISA法检测灰飞虱群体的带毒率为10%,即将该群体作为水稻黑 条矮缩病接种体使用。供试水稻种子浸种，催芽，至0.5叶时播于烧杯中， 到2. 0叶时淘汰病弱苗，每个材料鉴定20株左右，3次重复，按15虫/ 苗接入带毒灰飞虱。接种36小时后，将灰飞虱移走。移栽接种苗至秧盘， 置于玻璃房中，注意水、温管理；移栽15天后开始调查病害发生情况， 其后每3天调查一次，连续调查5次。按以下典型症状进行调查浓绿矮缩，分蘖期分蘖增多，叶片僵直，不抽穗或穗小，叶背的叶脉或茎秆上有 短条状突起。记录发病株数，计算发病率。结果显示4个转基因株系对水 稻黑条矮缩病的抗性水平较受体盐粳21和感病对照华粳6号有显著性提
高(表l)。
表l 2-5A转基因水稻株系对水稻黑条矮缩病的抗性表现
材料重复l重复2重复3平均 -差异显著性=0.01
a=0.05a=盐粳2157.10%56.30%60.00%57.67%A
华粳6号41.70%46.20%40.00%42.67%bB
4墨533.30%36.40%30.00%33.00%cC
4-425.00%23.跳20.00%22.67%dD
4-225.歸16.70%20.00%20.67%dD
4-623.腦16.70%17.50%19.33%dD
鉴于生产上缺乏抗病品种的现状，本方法可以为水稻黑条矮缩病的可
持续综合防控提供材料上的储备。同时由于2-5A系统来源于高等脊推动 物，因此其与病毒基因组发生互作的机会很小，不易出现病毒异源包被和 重组的情况，较之病毒来源转基因策略本方法从一定程度上规避了转基因 风险。
上述实施不以任何形式限定本发明。
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权利要求
1、2-5A合成酶和RNase L基因在提高水稻品种(系)对水稻黑条矮缩病抗性上的应用，其特征在于将2-5A合成酶和RNase L两基因全序列分别构建植物表达载体，转化水稻品种获得转基因再生植株，通过PCR多代筛选获得的转基因双阳性水稻品种(系)对水稻黑条矮缩病的抗性水平较转基因受体品种(系)有显著提高。
全文摘要
本发明公开了一种利用2-5A合成酶和RNase L基因转化水稻获得对水稻黑条矮缩病抗性提高的品种的新方法。本发明的实质是根据2-5A合成酶和RNase L响应于病毒dsRNA，进而降解病毒RNA以限制寄主体内病毒增殖的原理，将两基因全长序列导入水稻中表达来提高转基因品种(系)对水稻黑条矮缩病的抗性水平。鉴于当前生产上缺乏抗病品种的现状，本方法可以为水稻黑条矮缩病的可持续综合防控提供材料上的储备。
文档编号C12Q1/68GK101580848SQ20091003272
公开日2009年11月18日 申请日期2009年6月26日 优先权日2009年6月26日
发明者于嘉林, 任春梅, 刘伟华, 彤 周, 周益军, 季英华, 熊如意, 程兆榜, 洁 陈 申请人:江苏省农业科学院