大丽轮枝菌寡糖基转移酶靶基因片段及其干扰载体和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及大丽轮枝菌寡糖基转移酶复合体STT3亚基靴基因片段^及该靴基因 片段所转录的RNA，还涉及含有所述寡糖基转移酶复合体STT3亚基靴基因片段的干扰载 体，本发明进一步涉及所述大丽轮枝菌寡糖基转移酶复合体STT3亚基靴基因片段或干扰 载体在提高植物对大丽轮枝菌抗病性中的应用，属于大丽轮枝菌病程关键基因的克隆及应 用领域。
【背景技术】
[0002] 大丽轮枝菌（Verticilliumdahliae)，是一种上传性病原真菌，可1^危害多种 经济作物、果树和观赏花弁，造成巨大的经济损失（化adinEF，ThommaBP.Physiology andmolecularaspectsofVerticilliumwiltdiseasescausedbyV.dahliaeand V.albo-atrum.Molecularplantpathology2006,7:71-86.PangJ,ZhuY,LiQ,et al.DevelopmentofAgrobacterium-mediatedvirus-inducedgenesilencingand performanceevaluationoffourmarkergenesinGossypiumbarbadense.PLoSOne 2013, 8:e73211.)。病原菌由植物根部的伤口侵入，并在维管束系统内大量繁殖，导致植 物生长发育迟缓，叶片枯萎甚至死亡（TsrorLLevinAG.VegetativecompatiLbility andpathogenicityofVerticilliumdahliaeKleb.isolatesfromOliveinIsrael. JournalofPh^opathology2003,151:451-455·)。由于病原菌在上壤内存活能力很强， 周期非常长，并且主要存在于寄主的维管束系统内，因此针对此现状，采取^预防为主，综 合治理的方式。植株一旦发病，目前在大田中还没有非常有效的防治措施和药剂。
[0003] 众所周知，如果没有生物体内复杂的蛋白修饰及加工系统，蛋白不会发挥应 有的生物学功能。在内质网膜上进行的糖蛋白的组装过程中，寡糖基转移酶复合体催 化核屯、的寡糖基因连接到新合成的多版上。此外，对于真核生物体来说，蛋白完全丢 失N端的糖基化修饰那是非常致命的（HeleniusA，AebiM.Intracellularfunctions ofN-linkedglycans.Science2001, 291:2364-2369.SilbersteinS,Gilmore 民.Biochemistry,molecularbiology,andgeneticsoftheoligosaccharyl transferase.FA沈BJournal1996, 10:849-858.)D除了负责糖基化蛋白的生成，寡糖基 转移酶复合体还在分泌蛋白调节过程中作为重要的"开关"元件化empski肥，Imperiali B.Oligos过cch过ryltr过nsfer过se:gatekeepertothesecretoryp过thw过y.Current OpinioninQiemicalBiology2002,6:844-850·)。最近，酿酒酵母的寡糖基转移酶复合 体的9个亚基被全部鉴定出来，其中包括STT3亚基。其中的任何一个亚基的突变，将会 造成复合体功會b的丧失（Κη过uer民，LehleL.Theoligos过cch过ryltr过nsfer过secomplex fromyeast.BiochimicaBiophysicaActa1999,1426:259-273·)。STT3 亚基的突变， 将会影响复合体对底物的特异性识别（ZuffereyR，KnauerR，BurdaP，etal.STT3，a highlyconservedproteinrequiredforyesstoligos过cch过ryltr过nsfer过se activityinvivo.EMBOJournal1995,14:4949-4960·)。位于内膜系统STT3a亚基的突 变，可^提高拟南芥对于NaCl和渗透压的敏感度化oiwa H，Li F，McCully MG，et βΙ.?ιθ STT3a subunit isoform of the Arabidopsis oligosaccharyltransferase controls adaptive responses to salt/osmotic stress. Plant Cell 2003, 15:2273-2284·)。拟 南芥STT3a突变后，会减少受体类激酶表达量的减少，从而使植物的免疫力下降（Saijo Υ,Tintor N, Lu X，et al.民eceptor quality control in the endoplasmic reticulum for plant innate immunity. EMBO Journal 2009,28:3439-3449·)。酿酒酵母的STT3 突变后，可W影响蛋白持的N-糖基化进程，进而影响细胞壁的合成（化avan Μ, Suzuki Τ,民ekowicz Μ, et al. Genetic, biochemical, and morphological evidence for the involvement of N-glycosylation in biosynthesis of the cell wall betal, 6-glucan of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of fhe United States of America 2003,100:15381-15386. )D
[0004]W前对于寡糖基转移酶复合体STT3亚基的研究，主要集中于酶学方面的基本性 质（如酶在新合在蛋白质的加工、细胞壁合在^及信号传导中的作用等），在真菌中的研究 较少，尤其是其与致病性之间的关系。因此，W大丽轮枝菌的寡糖基转移酶复合体STT3亚 基作为祀基因，研究其与病原菌致病力之间的关系，筛选得到与抗大丽轮枝菌相关的寡糖 基转移酶复合体STT3亚基祀基因片段，对于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性将具有重要 的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明目的之一是提供大丽轮枝菌（Verticilliumd址liae)寡糖基转移酶复合 体STT3亚基祀基因片段W及所转录的RNA;
[0006] 本发明所目的之二是提供含有所述大丽轮枝菌寡糖基转移酶复合体STT3亚基祀 基因片段的RNA干扰载体和宿主细胞；
[0007] 本发明目的之Ξ是将所述寡糖基转移酶复合体STT3亚基祀基因片段或其转录的 RNA应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性或构建获得抗大丽轮枝菌的转基因植物新品 种。
[000引为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0009] 本发明首先公开了大丽轮枝菌（Verticilliumd址liae)寡糖基转移酶复合体 STT3亚基祀基因片段，其核巧酸序列分别为沈QIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQ IDNo.4或SEQIDNo.5所示；优选的，所述寡糖基转移酶复合体STT3亚基祀基因片段的 核巧酸序列为SEQIDNo.1、SEQIDNo.4或SEQIDNo.5所示；最优选的，所述寡糖基转移 酶复合体STT3亚基祀基因片段的核巧酸序列为SEQIDNo.4所示。
[0010] 本发明采用寄主诱导的基因沉默技术化ost-in化ced gene silencing)，W高致 病力的大丽轮枝菌株V991为实验材料，根据大丽轮枝菌STT3编码序列信息（其核巧酸序 列为SEQ IDNo.6所示），设计5对引物，克隆获得针对祀基因的5个不同区段，其核巧酸序 列分别为SEQ IDNo.1-5所示。本发明进一步将克隆获得的大丽轮枝菌基因的5个祀标片 段分别构建至TRV2载体中，成为VIGS系列RNAi载体并转化农杆菌，用于本氏烟草的注射， 从注射VIGS干扰载体后的第7天进行大丽轮枝菌接种。病情指数分析结果表明，与空载