082] 1.2本氏烟草的转化
[0083] 取生长在MS基本培养基上的本氏烟草叶片，除去边缘和主要叶脉，切成 0. 4X0. 6cm大小的小段，放入0D600为0. 1-0. 2的含有阳性质粒的农杆菌LBA4404菌液中 浸泡5min，用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液。然后将小叶片置于铺有一层滤纸的烟草 芽分化培养基（MS+NAA0. 2mg/L+6-BA2mg/L)上进行培养，25°C暗室内培养3天。将经过 共培养的烟草外植体转移到含有相应抗生素的筛选培养基（MS+NAA0. 2mg/L+6-BA2mg/ L+KanlOOmg/L+Carb500mg/L)中进行培养，光照周期为1化光照/化黑暗。2-3周后待 抗性芽生长至l-2cm高时，用无菌手术刀切下小芽转入生根培养基（MS+KanlOOmg/L+Carb 500mg/L)中诱导生根，1~2周后就会有不定根形成。然后提取转基因植物DM,并进行PCR 检测（表4)，获得转基因阳性植株。
[0084] 表4、检测引物信息
[0085]
[0086] 1. 3真菌生物量检测
[0087] 为了比较转基因本氏烟草与野生型本氏烟草中病原菌的生物量变化，本发明利用 qRT-PCR测定不同植物基因型根部大丽轮枝菌的生物量。提取接菌12天本氏烟草根部总 DNA，W大丽轮枝菌内部转录间隔区ITS为祀标片段，同时W本氏烟草的持家基因actin为 持家片段，进行相对定量测定（表5)。
[0088] qRT-PCR反应在AB口500上反应完成，结果采用2& 法进行结果分析。引物的 单峰性W及扩增效率满足实验要求。
[0089] 表5巧光定量引物信息
[0090]
[0091] 1. 4祀基因的表达量分析
[0092] 为了确定本氏烟草抗性的提高与祀基因的下降存在一定的关系，本发明利用 qRT-PCR进一步测定本氏烟草中祀基因的转录水平。提取接菌12天本氏烟草根中总RNA， 并进行反转录分析。W病原中STT3基因的编码序列设计引物作为目的片段（表6)，同时W 病原菌actin作为持家片段，进行转录水平的相对定量测定。
[0093] qRT-PCR反应在AB口500上反应完成，结果采用2& 法进行结果分析。引物的 单峰性W及扩增效率满足实验要求。
[0094] 表6巧光定量引物信息
[0095]
[009引 2、实验结果
[0097] 2. 1转基因植株的获得
[0098] 通过VIGS筛选的方法，获得了可W提高植物对病原菌抗性的祀标区段。为了进一 步验证寡糖基转移酶复合体STT3亚基与病原菌致病性之间的关系，W及干扰后能显著降 低病原菌致病力的区段，并获得稳定遗传的转基因本氏烟草，本发明设计了针对祀基因的 引物，引物两端带有BP位点，通过扩增获得了目的基因片段。从电泳图5中可W发现明亮 的目的条带。通过进一步的DNA测序、比对后发现，序列与祀标序列完全一致。
[0099] 通过BP反应和LR反应，将克隆获得的3个寡糖基转移酶复合体STT3亚基祀标片 段连接到Gateway干扰载体地7GWIWG2 (I)，0上（图6)，形成含有真菌祀基因的植物转化载 体。
[0100] 为了获得能够稳定遗传针对病原菌祀基因STT3的dsRNA，通过农杆菌介导及组织 培养的方法，将构建好的Gateway干扰载体转化至本氏烟草，最终获得转基因烟草（图7、8、 9)。
[0101] 2. 2转基因烟草的抗病性分析
[0102] 对获得的含有寡糖基转移酶复合体STT3亚基不同区段dsRNA的阳性转基因烟草， 进行大丽轮枝菌接种。然后从接种后第10天、第11天和第12天进行病情指数分析。从图 10可W看出，转基因烟草对病原菌的抗性明显提高，病情指数下降约55-80%。
[0103] 提取转基因烟草根部DNA，利用qRT-PCR进行真菌生物量分析。从图11可W看出， 转基因阳性烟草的真菌生物量明显降低，仅为野生型的30-50%。
[0104] 病情指数统计W及真菌生物量分析，可W明显观察到RNAi-4组转基因烟草对病 原菌具有更强的抗性。
[0105] 2. 3祀基因的表达量分析
[0106] 为了进一步验证植物病情指数降低与祀基因表达之间的关系，通过对植物根部病 原菌祀基因的表达量分析，可W观察到与野生型植物相比，转基因植物体内祀基因表达量 下降了约30-50% (图12)。运说明STT3基因的区段4 (核巧酸序列为SEQIDNo. 4所示） 作为祀标片段设计dsRNA，可W达到最佳的干扰效果，从而可W有效降低病原菌的致病力。
【主权项】
1. 大丽轮枝菌（Verticilliumdahliae)寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段， 其特征在于：其核苷酸序列为SEQIDNo. 1、SEQIDNo. 2、SEQIDNo. 3、SEQIDNo. 4 或 SEQIDNo. 5所示；优选的，其核苷酸序列为SEQIDNo. 1、SEQIDNo. 4或SEQIDNo. 5所 不。2. 由权利要求1所述的寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段所转录的RNA。3. 含有权利要求1所述的寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段的RNA干扰载体； 优选的，所述RNA干扰载体是Gateway干扰载体。4. 一种构建权利要求3所述RNA干扰载体的方法，其特征在于，包括：将权利要求1所 述的寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段插入到Gateway干扰载体，即得； 优选的，通过BP反应，将权利要求1所述的寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段 连接至PD0NR207中，再通过LR反应，将其构建至pK7GWIWG2 (I)，0中，得到Gateway干扰载 体。5. 权利要求1所述寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段或权利要求2所述的RNA 在提高植物对大丽轮枝菌的抗病性中的应用。6. 按照权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：（1)构建含有权利要求1 所述寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段的RNA干扰载体；（2)将所构建的RNA干扰 载体转化到植物或植物细胞中；（3)筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物。7. 权利要求3所述RNA干扰载体在提高植物对大丽轮枝菌的抗病性中的应用。8. 按照权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：（1)将权利要求3所述 RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；（2)筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因 植物。9. 一种培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 构建含有权利要求1所述寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段的RNA干扰载体； (2) 将所构建的RNA干扰载体转化到植物或植物细胞中；（3)筛选获得对大丽轮枝菌抗病性 提尚的转基因植物新品种。10. 按照权利要求5或7所述的应用，其特征在于，所述植物包括：大丽轮枝菌的寄主 植物；优选的，所述植物包括：棉花、烟草、番茄、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜或花生中的任意 一种或多种。
【专利摘要】本发明公开了大丽轮枝菌寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段及其干扰载体和应用，属于大丽轮枝菌病程关键基因的克隆及应用领域。本发明采用寄主诱导的基因沉默技术筛选寡糖基转移酶复合体STT3亚基基因中能明显降低病情指数的靶基因片段，进一步构建Gateway干扰载体，获得对病原菌抗性明显提高的稳定遗传的转基因烟草。通过病情指数、真菌生物量分析和靶基因转录水平检测，最终筛选得抗大丽轮枝菌效果最佳的寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因干扰区段。本发明大丽轮枝菌相关的寡糖基转移酶复合体STT3亚基靶基因片段及RNA干扰载体能应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病能力以及培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种。
【IPC分类】C12N15/31, A01H5/00, C12N15/63, C12N15/11
【公开号】CN105255909
【申请号】CN201510792533
【发明人】苏晓峰, 齐希梁, 程红梅, 郭惠明
【申请人】中国农业科学院生物技术研究所
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月17日