方式】
[0041] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领 域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可W对本发明技术方案的细节 和形式进行修改或替换，但运些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0042] 1、材料
[0043] 1. 1烟草
[0044]本氏烟草（化cotianabenthamiana)品系。
[0045] 培养条件：种植于高溫高压灭菌的混合营养± (芳洁营养± :赔石=1 :1)中，溫 度23±2°C，相对湿度75 + 5%，光周期L:D为16h:她。
[0046] 1. 2菌株和质粒
[0047] 棉花黄萎病原菌：大丽轮枝菌（Verticilliumd址liae)V991，高致病力落叶型菌 株，由中国农科院植保所简桂良研究员惠赠。
[0048] 病毒载体：烟草脆裂病毒灯obacco rattle virus, TRV)双元载体灯RV1与TRV2) 由清华大学刘玉乐教授惠赠。
[0049] 农杆菌：菌株GV3101和LBA4404,由本发明人实验室保存。
[0050]植物稳定遗传载体：PD0NR207和地7GWIWG2 (I)，0载体由本发明人实验室保存。
[0051] 实施例1大丽轮枝菌（Verticilliumd址liae)的寡糖基转移酶复合体STT3亚基 祀基因筛选
[0052] 1、实验方法
[0053] 1. 1 VIGS干扰载体的构建
[0054] 为了筛选获得干扰效果最佳的祀基因区段，根据大丽轮枝菌寡糖基转移酶复合体 STT3 亚基（oligosaccha巧 1transferaseSTT3subunit，VDAG_03232.1)的编码序列，设计 5对特异性引物（表1)，引物两端含有EcoRI和BamHI酶切位点，分别对目的片段进行PCR扩增。然后利用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，并进行片段回收。将目的片段化及 载体分别进行酶切反应，并利用T4连接酶将其构建至TRV2载体中。最后，利用酶切W及测 序分析，将验证好的阳性质粒转化至农杆菌GV3101中。
[00巧]表1STT3基因不同区段引物信息 [0056]
[005引注：加粗、斜体处为酶切位点。
[005引1. 2 VIGS转化方法
[0060] 将含有TRV1与TRV化祀基因片段阳性质粒的农杆菌单克隆放于LB液体培养基 (25μg/mLRif和50μg/mLKan)中，28°C摇床过夜培养。次日将菌液（比例为2% )加 入LB液体培养基中再次培养，振荡培养至0D600为0. 5-0. 6时，低溫离屯、收集菌体。弃去 废液，将菌体重悬于注射基质（lOmMMES、10mMMgCl2、l〇〇yM乙酷下香酬）中，调整0D600 至0.8-1.0。把两种农杆菌菌株（TRV1与TRV化祀基因片段）Wl:l混合，在室溫中静置 3-5h，不要摇动。最后利用注射器将农杆菌混合液注射于最嫩的叶片中。
[0061] 1. 3真菌的培养W及植物接种方式
[0062] 将大丽轮枝菌抱子培养于液体CM培养基中，25°C振荡培养5-7天。经5层纱布过 滤，离屯、收集抱子。用蒸馈水稀释，并在显微镜下观察，将抱子浓度调整至1〇 6个/ml后备 用。
[0063] 当本氏烟草的叶片长至6-8片真叶时，选取长势一致的本氏烟草幼苗进行大丽轮 枝菌接种。用綴子从根部将幼苗挖出，并在蒸馈水中清洗根部泥±。将幼苗根部完全浸泡 于稀释好的1〇6个/mL抱子悬液或蒸馈水中2min后，尽快将幼苗移回原来的塑料鉢中，并 诱水，使±壤湿润。
[0064] 1. 4植物病情指数统计
[00巧]根据相关文献（WangHM,LinZX,ZhangXl^,etal.Mappingandquantitative traitlocianalysisofVerticilliumwiltresistancegenesincotton.Journalof IntegrativePlantBiology2008, 50:174-182·)，并做出适当调整，制定出了本氏烟草感 染大丽轮枝菌的病情等级（表2)。病情指数计算公式如下：
[0066]病情指数=[Σ(numberXlevel)八1:01日1plantXhi曲estlevel) ]X100
[0067] 表2病情指数统计
[0068]
[006引 2、实验结果
[0070] 2. 1大丽轮枝菌寡糖基转移酶复合体STT3亚基干扰载体的构建
[0071] 本发明采用的为清华刘玉乐老师提供的烟草脆裂病毒（Tobaccorattlevirus， TRV)载体（图1)。TRV的cDNA位于双35S启动子和姻脂碱合成酶终止子（nopaline synthaseterminator,NOSt)之间。TRVl包含了 病毒的RNA依赖的RNA聚合酶（RNA cbpendentRNApolymerase,R服p)、可移动蛋白（MovementProtein,MP)、16kDa富含 半脫氨酸区域等其它元件。TRV2包含病毒的衣壳蛋白（coatprotein,CP)、多克隆位点 (multiplecloningsite,MC巧等其它元件。多克隆位点的引入，方便了外源基因的插入。
[0072] 本发明根据大丽轮枝菌寡糖基转移酶复合体STT3亚基编码序列信息（其核巧酸 序列为SEQIDNo. 6所示），设计引物，扩增获得针对祀基因的5个不同区段（图2)，其核 巧酸序列分别为沈QIDNo. 1、SEQIDNo. 2、沈QIDNo. 3、SEQIDNo. 4、SEQIDNo. 5 所 /J、- o
[0073] 通过BamHI和EcoRI将克隆获得的大丽轮枝菌基因的祀标片段进行酶切，然后将 其构建到TRV2载体中，成为VIGS系列RNAi载体。通过酶切和DNA测序进行验证后，发现序 列与祀标片段序列完成一致（图3)。然后，将验证正确的阳性质料转化至农杆菌GV3101， 用于本氏烟草的注射。
[0074] 2. 2本氏烟草的病情指数分析
[0075] 从注射后的第7天起，本氏烟草的新生嫩芽开始出现白化现象。待到第10天，新 生的叶片全部为白色，并且运种叶片白化的现象可W持续45天。运表明，接种后的第7天， 本氏烟草体内VIGS载体已经产生出大量dsRNA，并发挥着干扰作用。因此，本发明选择了从 注射VIGS系列载体后的第7天，进行1〇6个/mL抱子悬液的薩根法接种。对接菌后的第10 天（dayspost-inoculation,化i)、11化i和12化i进行本氏烟草的病情指数统计。结果显 示（图4)，与空载相比，注射真菌祀基因片段的本氏烟草，病情指数均有所下降；随着天数 的增加，病情指数逐渐上升。部分基因组烟草中，即分别注射了VIGS系列载体VIGS-1 (祀标 片段的核巧酸序列为SEQIDNo. 1所示）、VIGS-4(祀标片段的核巧酸序列为SEQIDNo.4 所示）、VIGS-5 (祀标片段的核巧酸序列为SEQIDNo. 5所示），病情指数一直保持在较低 水平，初步说明祀标片段的引入与病原菌的致病性存在一定关系，它们可W降低植物的病 情指数。
[0076] 实施例2Gateway干扰载体的构建及植物转化
[0077] 1、实验方法
[0078] 1. 1稳定遗传载体的构建
[0079] 为了获得稳定遗传的含有祀基因dsRNA的本氏烟草，根据实施例1瞬时转化的烟 草病情指数的变化，对能够明显提高植物对病原菌抗性的Ξ个DNA区段（核巧酸序列分别 为SEQIDNo. 1、SEQIDNo. 4、SEQIDNo. 5所示），重新设计引物（两端含有部分BP位 点），然后再用attb引物进行扩增（表3)，用于稳定遗传干扰载体的构建。根据BP反应， 将祀标序列连接至PD0NR207中；然后通过LR反应，将其构建至地7GWIWG2 (I)，0中。最后 将构建好的载体转化至农杆菌LBA4404中。
[0080] 表3、稳定遗传干扰引物信息
[0081]
[0