杭州毛刺线虫RFLPs检测鉴定方法及相应基因的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于农林病害检测技术领域，具体设及一种毛刺属线虫新种的RFLPs(限 制性片段长度多态性）检测鉴定方法及相应的杭州毛刺线虫灯richodorus hangzhouensis η. sp.)的rDNA-ITSl序列和rDNA-ITS2序列。
【背景技术】 阳00引毛刺属（Trichodorus Cobb, 1913)线虫隶属于线虫口 阳ematoda(Rudolphi, 1808)Lankester, 1877]，无侧尾腺纲（Adeno地orea von Linstow, 1905)，Ξ矛目（Triplonchida Cobb, 1920)，膜皮亚目值iphthero地orina Coomans&Loof, 1970)，毛刺总科[Trichodoridea Thorne,1935(Siddiqi, 1974)]， 毛刺科[Trichodoridae Thorne,1935(Siddiqi, 1961)]，毛刺亚科（Trichodorinae Thorne, 1935)，是一类重要的植物外寄生线虫，可寄生于植物根部，影响根系生长，甚至引 起根部生长停滞，导致植物短粗根病。属内的许多种群还是一些植物病毒的传播介体，如 T.primitivus是烟草脆裂病毒灯RV)和魏豆早褐病毒（P邸V)的传播介体，可使豆类作物、 紫花首猜、黄瓜、番茄、甜菜等许多经济作物染病，造成严重的经济损失。近年来，随着国际 间贸易往来的日益频繁，进出境种苗及其植物繁殖材料增多，各种植物病害尤其是线虫病 害传播的机会大大增加，使得植物线虫成为世界各国广泛关注的对象。
[0003] 就毛刺属线虫而言，自著名线虫学家deMan于1880年描述了第一个毛刺属线 虫Do巧laimusprimitivus，Co化于1913年建立了毛刺线虫属后，世界各地描述了很多 毛刺属线虫新种，截止目前该属共描述55个有效种。当前该属线虫的检测鉴定主要依赖 形态分类方法，即基于雌虫和雄虫的形态学特征和形态测量值，但由于属内线虫种间存在 许多形态学极为相似或很难观察到的特征，如雌虫阴口骨化块的形状及大小、侧体孔的有 无及数量，雄虫腹中颈乳突的数量及其与排泄孔的位置关系、交合刺纹饰的有无及形态、精 子的形态等，使得种间的差别有时不是很明显，增加了鉴定的难度。基于此，人们开始尝试 采用PCR技术等方法来研究该属线虫，如Boutsika等利用PCR扩增了Paratrichodorus macrostylus,P.pachydermus,Trichodorusprimitivus和T.similis的 18SRNA区、 rDNA-ITSl区及rDNA-ITS2区基因，并对所得序列进行了分析，得到运4个种的种特异性引 物出oleva等利用实时巧光PCR法研究了毛刺属介体线虫与烟草脆裂病毒的关系。
[0004] 杭州毛刺线虫（Trichodorushangzhouensisη.sp.)是采集于浙江省杭州市批把 根围的一毛刺属线虫新种，是一记录种，目前国内外尚无其的系统研究报道。在已有的文章 中将其命名为化ichodorusη.sp.。
【发明内容】
阳0化]本发明要解决的技术问题是提供一种毛刺属线虫新种的RFLPs检测鉴定方法及 相应的基因。 W06] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种杭州毛刺线虫（Trichodorus hangzhouensisη.sp.)基因，具有沈QIDN0:1 所述的rDNA-ITSl序列（1802bp)。
[0007] 作为本发明的杭州毛刺线虫（Trichodorushangzhouensisη.sp.)基因的改进： 还具有沈QIDN0:2所述的rDNA-ITS2序列（874bp)。
[0008] 本发明还同时提供了一种杭州毛刺线虫RFLPs检测鉴定方法，依次包括如下步 骤：
[0009] ①、提取待测线虫（特别是毛刺线虫）的DNA模板；
[0010] ②、进行rDNA-ITSl和rDNA-ITS2 区PCR反应： W11]rDNA-ITS1区序列扩增采用的引物为：
[0012] VI:5'-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3'，
[0013] 口SB:5'-GCTGCGTTCTTCATCGAT-3< ;
[0014] rDNA-ITS2区序列扩增采用的引物为：
[0015] 口SA:5'-ATCGATGAAGAACGCAGC-3'
[0016] V2 :5'-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3';
[0017] ③、进行PCR产物纯化，得PCR纯化产物； 阳01引④、判定：
[0019] PCR纯化产物能同时得到rDNA-ITSl序列和rDNA-ITS2序列的为杭州毛刺线 虫（Trichodorushangzhouensisη.sp.);反之，则判定不是杭州毛刺线虫（Trichodorus h曰ngzhouensisη.sp.)〇
[0020] 作为本发明的杭州毛刺线虫RFLPs检测鉴定方法的改进，该RFLPs检测鉴定方法 还包括W下步骤：
[0021] 一、将步骤③所得的PCR纯化产物进行酶解（目的是进行RFLPs分析）： 阳02引 rDNA- 口S1区PCR产物酶切反应采用的限制性内切酶分别为：AvaI，Bg II,HindIII,ΚρηI,NciI,PstI; 阳02引 rDNA-ITS2区PCR产物酶切反应采用的限制性内切酶分别为：DdeI，Hinf I,MvaI,化iI,PstI,RsaI;
[0024] 二、将rDNA-ITSl、rDNA-ITS2分别所得的酶解液分别进行酶切反应结果的读取； 阳0巧]将rDNA-ITSl、rDNA-ITS2分别所得的酶解液分别进行如下步骤：
[0026] 将10μ1酶解液与2μ1 6Xloadingbuffer混匀，进行电泳；然后进行染色、再 于紫外灯下观察、拍照（具体为：于1. 3%琼脂糖凝胶（w/v)UXTAE电泳缓冲液中，在75V 稳压下电泳，电泳结束后，置于0. 1 %的邸溶液（w/v)中染色lOmin，后在紫外灯下观察、拍 昭.）
[0027] 当结果符合下表1所述的rDNA-ITSl、rDNA-ITS2酶切后片段大小时，判定该待测 线虫为杭州毛刺线虫（Trichodorushangzhouensisη.sp.); 阳02引反么当结果不符合下表1所述的rDNA-ITSlJDNA-ITS2酶切后片段大小时，判定 该待测线虫不是杭州毛刺线虫（Trichodorushangzhouensisη.sp.);
[0029] 表 1、rDNA-ITSl、rDNA-ITS2 酶切后片段大小
[0030]
[0031] 作为本发明的杭州毛刺线虫RFLPs检测鉴定方法的进一步改进： 阳0巧所述步骤②中：
[0033] 25μL的PCR反应体系为：DNA模板 2μL、10XPCRbuffer(含Mg2+) 2. 5μL、 2. 5mmol/LdNTP2μL、40μL?οΙ/μL各引物 1μL、5U/μLTaq酶 0. 3μL、（1地2〇补足至 25μL(即，16. 2μL);
[0034] PCR扩增程序为：94°C预变性 3min，94°C变性 45s、52°CaTSl区）或 55°CaTS2 区）退火50s、72°C延伸2min、35个循环，72°C总延伸lOmin。
[0035] 作为本发明的杭州毛刺线虫RFLPs检测鉴定方法的进一步改进：
[0036] 10μL的酶切反应体系为：PCR纯化产物6μL、限制性内切酶1μL、10X缓冲液 (为每种限制性内切酶自带的缓冲液）1μL(1地2〇2μL;
[0037] 酶切反应程序为：离屯、机离屯、3~5秒后，于37 + 0. 5°C培养箱内保溫至少化。
[0038] 作为本发明的杭州毛刺线虫RFLPs检测鉴定方法的进一步改进： W39] 步骤①的DNA模板提取为：
[0040] 将 2 条待测线虫放入至含 18μ1 10XPCR-buffer(Mg2+free)的 0. 5μ1e卵endo计 管中，加入2μ1 600yg/ml蛋白酶Κ后置于-70°C，20min后，转入PCR仪中65°C60min， 95°ClOmin，后 12000r/min离屯、2min，获得DNA模板。
[0041] 本发明的杭州毛刺线虫RFLPs检测鉴定方法，在DNA模板的提取过程中直接挑取2 条目的线虫（待测线虫）至巧pendoW管中，而非在载玻片上切碎目的线虫后再用移液器 吸取线虫片段，明显减少了操作步骤和目的线虫DM的损失量；rDNA-ITSl和rDNA-ITS2区 经PCR扩增后酶切反应分析，很容易将T.hangzhouensis与其他线虫区分开来，而传统形态 学鉴定方法需要雌、雄成虫各10条左右，本发明的方法较传统方法省虫省时省力；提供了 毛刺属一线虫新种的分子检测鉴定方法。
[0042] 本发明提供了利用PCR-RFLPs检测鉴定毛刺线虫属一新种一杭州毛刺线虫的方 法，操作人员无需具备较多的线虫学专业知识，可操作性强，较传统的形态学鉴定方法省虫 省时省力，是一种操作简便、高效率的病原线虫检测鉴定新方法。
【附图说明】
[0043] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细说明。
[0044] 图 1 是rDNA-ITSl序列（1802bp);
[0045] 图 2 是rDNA-口S2 序列（874bp);
[0046] 图 3 是杭州毛刺线虫（Trichodorushangzhouensisη.sp.)的rDNA-ITSl-RFLPs 图谱；
[0047] 图 4 是杭州毛刺线虫（Trichodorushangzhouensisη.sp.)的rDNA-ITS2-RFLPs 图谱；
[0048] 图 5 是南京毛刺线虫灯.nanjingensis)的rDNA-ITSl-RFLPs图谱；
[0049] 图 6 是南京毛刺线虫灯.nanjingensis)的rDNA-ITS2-RFLPs图谱； 阳化0] 图7是己基斯坦毛刺线虫化pakistanensis)的rDNA-ITSl-R化Ps图谱；
[0051] 图8是己基斯坦毛刺线虫化pakistanensis)的rDNA-ITS2-R化Ps图谱；
[0052] 图9是雪松毛刺线虫灯.cedarus)的rDNA-ITSl-RFLPs图谱；
[0053] 图10是雪松毛刺线虫灯.cedarus)的rDNA-ITS2-RFLPs图谱。
[0054] 图中，U代表未经限制性内切酶酶切的ITS1^TS2PCR产物片段，即PCR产物不经 限制性内切酶酶切。
【具体实施方式】 阳化5] 实施例1、一种杭州毛刺线虫RFLPs检测鉴定方法，依次进行W下步骤：
[0056] ①提取DNA模板：在解剖镜下挑取2条完全相同的目的线虫（待测线虫）-杭州毛 刺线虫放入至含 18μ1 10XPCR-buffe;r(Mg2+free)的 0. 5μ1e卵endo;rf管中，加入 2μ1 600yg/ml蛋白酶Κ后迅速将管置于-70°C冰箱，20min后转入PCR仪中65°C60min，95°C lOmin，后 12000r/min离屯、2min，即获得DNA模板。
[0057] ②进行rDNA-ITSl和rDNA-ITS2 区PCR反应： 阳化引rDNA- 口S1区序列扩增采用的引物为：
[0059] Vl(5'-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3')和ITSB巧'-GCTGCGTTCTTCATC GAT-3')、 W60]rDNA-ITS2区序列扩增采用的引物为：
[0061] ITSA巧'-ATCGATGAAGMCGCAGC-3')和V2巧'-TTTCACTCGCCGTTACTA AGG-3')。
[0062] PCR反应体系（25μL)为：DNA模板 2μL、10XPCRbuffer(含Mg2+) 2. 5μL、 2.5mmol/LdNTP2μL、40μmol/μL各引物lμL、5U/μLTaq酶0.3μL、d地20 16.2μL。
[0063] PCR扩增程序为：94°C预变性 3min，94°C变性 45s、52°CaTSl区）或 55°CaTS2 区）退火50s、72°C延伸2min、35个循环，72°C总延伸lOmin。
[0064] ③进行PCR产物纯化：
[00化]PCR反应完成后，对步骤②所得的2种PCR产物分别进行如下的纯化：
[0066]将 25μ1PCR产物与 5μ1 6Xloadingbuffer混匀，于 1. 0%琼脂糖凝胶（w/v)、 I XTAE电泳缓冲液中，在90V稳压下进行电泳，电泳结束后（即，直至倒数第4格时结束电 泳），置于0. 1 %的邸溶液（w/v)中染色lOmin，选用上海Sangon公司的UNIQ-10柱式DNA 胶回收试剂盒进行回收、纯化。 W67] 分别得到图1和图2所述（旨P，沈QIDNO: 1和沈QIDNO:2)的序列。
[0068] ④进行RFLPs分析： W例 rDNA-ITS1区