大丽轮枝菌腺苷酸激酶靶基因片段及其干扰载体和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及大丽轮枝菌腺巧酸激酶祀基因片段W及该祀基因片段所转录的RNA， 还设及含有所述腺巧酸激酶祀基因片段的干扰载体，本发明进一步设及所述大丽轮枝菌相 关的腺巧酸激酶祀基因片段或干扰载体在提高植物对大丽轮枝菌抗病性中的应用，属于大 丽轮枝菌病程关键基因的克隆及应用领域。
【背景技术】
[0002] 棉花黄萎病（Verticilliumwilt)是一种典型的±传性维管束系统性病害，主要 影响着中国棉花的优质和高产，被称为"棉花癌症"（简桂良，邹亚飞，马存.棉花黄萎病 连年流行的原因及对策.中国棉花.2003, 30:13-14.)。在中国，其病原菌主要为大丽轮枝 菌（Verticilliumd址liae)。它首先是从植物的根部进行侵染，再经植物的表皮、皮层和 统管束大量繁殖，并进行系统性侵染，最终使整个植株矮小，黄化、萎黨甚至死亡（Wi化elm S.LongevityoftheVerticilliumwiltfungusinthelaboratoryandfield, ^^opathology1955,45:180-181.)。由于其生理小种众多、变异较快，且致病机理复杂， 目前还没有十分有效的防治方法。
[0003] 腺巧酸代谢是初生代谢的重要组成部分，腺巧酸类化合物的含量变化被认为是影 响细胞代谢的主要因素之一（AtkinsonD.Theenergychargeoftheadenylatepool asregulatoryparameterYinteractionwithfeedbackmodifiers.Biochemistry 1968, 11:4030-4034.)。腺巧酸激酶（adenylatekinase,AK)是细胞中一种重要的憐酸转 移酶，广泛的存在于真核生物与原核生物中，催化AMP+ATP形成2分子ADP的可逆反应，为 生物体的生命活动提供所需能量（JanssenE,DzejaPP,0e;rlemansF,etal.Adenylate kinaseIgenedeletiondisruptsmuscleenergeticeconomydespitemetabolic rearrangement.EMBOJournal2000,19:6371-6381.)。同时，它也是一种核巧酸激酶，调节 生物体内ADP、ATP、AMP或dATP的之间的浓度，其表达量直接影响腺巧酸在糖类代谢库和核 酸代谢库中的分配（SchlattnerU,Wa即erE,G;reppinH,etal.Qiloroplastadenylate kin曰sefromtob曰ccopurific曰tion曰ndp曰rti曰1ch曰r曰cteriz曰tion.Phytochemistry 1996, 42:589-594.)。此外，AK通过局部或暂时调节AMP的水平来激活腺巧酸活化蛋白激酶(AMPactivatedproteinkinase,AMPK)，使得生物体内受AMP影响的酶和代谢感受物能够 更加敏感和准确地对应激信号做出反应（SaltonSR.化urotro地ins,growth-factor-regu latedgenesandthecontrolofenergybalance.MountSinaiJournalofMedicine 2003, 70:93-100;YamauchiT,KamonJ,MinokoshiY,etal.Adiponectinstimulates glucoseutilizationandfatty-acidoxidationbyactivatingAMP-activated proteinkinase.化 1:ureMedicine2002, 8:1288-1295)oAK可W促进肌原纤维收缩的速率 和振幅。抑制AK的活性，可W减少肌动蛋白的收缩和线粒体的呼吸作用，并且使线粒体和 肌原纤维之间能量的流动减慢值zejaPP,VitkeviciusKT,Re壯ieldMM,etal.Adenylate kin曰se-c曰t曰lyzedphosphotr曰nsferinthemyoc曰rdium:incre曰sedcontributionin heartfailure.CirculationResea;rchl999, 84:1137-1143.)。用铁酸四了醋处理细胞 时，当环境中ATP浓度较低时，细胞会出现坏死的情况；当环境中ATP浓度较高时，细胞 则会W调亡的形式死亡，同时伴随有大量的AK从线粒体膜间释放出来（Stri化H，Fava E,SingleB,et曰1.Tributyltin2induced曰poptosisrequiresglycolytic曰denosine trisphosphateproduction.ChemicalResearchinToxicology1999, 12:874-882.)。位 于局部非折叠区的从鄉氨酸到甘氨酸的一小段序列对AK结构的稳定性起到了非常关键的 作用(AndersonJA,Hilser,VJ.FunctionalunfoldinginE.coliadenylatekinase. Bio地ysicalJournal2015,108:30a.)。
[0004] W前对于腺巧酸激酶基因的研究，主要集中于酶学方面的基本性质（如酶在能量 平衡W及对外界环境抗性中的作用等），在真菌中的研究较少，尤其是其与致病性之间的关 系。因此，W大丽轮枝菌的腺巧酸激酶基因作为祀基因，研究其与病原菌致病力之间的关 系，筛选得到与抗大丽轮枝菌相关的腺巧酸激酶祀基因片段，对于提高植物对大丽轮枝菌 的抗病性将具有重要的意义。
【发明内容】
[0005] 本发明目的之一是提供大丽轮枝菌（Verticilliumd址liae)腺巧酸激酶祀基因 片段W及所转录的RNA;
[0006] 本发明目的之二是提供含有所述大丽轮枝菌腺巧酸激酶祀基因片段的RNA干扰 载体和宿主细胞；
[0007] 本发明目的之Ξ是将所述大丽轮枝菌腺巧酸激酶祀基因片段或其转录的RNA应 用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性或构建获得抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种。
[000引为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0009] 本发明首先公开了大丽轮枝菌（Verticilliumd址liae)腺巧酸激酶祀基因片段， 其核巧酸序列分别为沈QIDNo. 1、SEQIDNo. 2、SEQIDNo. 3或沈QIDNo. 4所示；优选 的，所述腺巧酸激酶祀基因片段的核巧酸序列为SEQIDNo. 1、SEQIDNo. 4所示；最优选 的，所述腺巧酸激酶祀基因片段的核巧酸序列为SEQIDNo. 4所示。
[0010]本发明采用寄主诱导的基因沉默技术化ost-in化cedgenesilencing)，w高致 病力的大丽轮枝菌株V991为实验材料，根据大丽轮枝菌AK编码序列信息（其核巧酸序列 为SEQIDNo.5所示），设计4对引物，克隆获得针对祀基因的4个不同区段，其核巧酸序 列分别为SEQIDNo. 1-4所示。本发明进一步将克隆获得的大丽轮枝菌基因的4个祀标片 段分别构建至TRV2载体中，成为VIGS系列RNAi载体并转化农杆菌，用于本氏烟草的注射， 从注射VIGS干扰载体后的第7天进行大丽轮枝菌接种。病情指数分析结果表明，与空载相 比，注射真菌祀基因片段的本氏烟草，病情指数均有所下降；其中分别注射VIGS系列载体 VIGS-1 (祀标片段的核巧酸序列为SEQIDNo. 1所示）、VIGS-4(祀标片段的核巧酸序列为 SEQIDNo. 4所示）的烟草，病情指数一直保持在较低水平，初步说明祀标片段的引入与病 原菌的致病性存在一定关系，它们可W降低植物的病情指数。
[0011]此外，由沈QIDNo. 1、SEQIDNo. 2、SEQIDNo. 3 或沈QIDNo. 4 所示的腺巧酸 激酶祀基因片段所转录的RNA也自然包含在本发明的保护范围之内。
[0012] 本发明所述腺巧酸激酶祀基因片段或所述的腺巧酸激酶祀基因片段所转录的RNA 能够应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性，包括W下步骤：（1)构建含有所述腺巧酸激 酶祀基因片段的RNA干扰表达载体；（2)将所构建的RNA干扰表达载体转化到植物或植物 细胞中；（3)筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植物。
[0013] 本发明进一步公开了含有所述腺巧酸激酶祀基因的RNA干扰载体W及含有所述 RNA干扰载体的宿主细胞。
[0014] 构建含有所述腺巧酸激酶祀基因的RNA干扰载体的方法为本领域技术人员所熟 知，优选为Gateway技术，只需BP反应和LR反应就可W完成RNA干扰表达载体的构建。
[0015] 优选的，一种构建RNA干扰表达载体的方法，包括：通过BP反应，将权利要 求1所述的腺巧酸激酶祀基因片段连接至PD0NR207中，再通过LR反应，将其构建至 PK7GWIWG2 (I)，0中，得到Gateway干扰载体。
[0016] 本发明所述RNA干扰载体也能够应用于提高植物对大丽轮枝菌的抗病性，包括W 下步骤：（1)将所述RNA干扰表达载体转化到植物或植物细胞中；(2)筛选获得对大丽轮枝 菌抗病性提高的转基因植物。
[0017] 本发明还公开了一种培育抗大丽轮枝菌的转基因植物新品种的方法，包括W下步 骤：（1)构建含有所述腺巧酸激酶祀基因片段的RNA干扰表达载体；(2)将所构建的RNA干 扰表达载体转化到植物或植物细胞中；（3)筛选获得对大丽轮枝菌抗病性提高的转基因植 物新品种。
[0018] 本发明所述转化的方案W及将所述核巧酸引入植物的方案可视用于转化的植物 或植物细胞的类型而变化。将所述核巧酸引入植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿 孔、农杆菌介导的转化和直接基因转移等。
[0019] 本发明所述植物包括：大丽轮枝菌的寄主植物，优选为农作物，包括：棉花、烟草、 番茄、马铃馨、甜瓜、西瓜、黄瓜或花生中的任意一种或多种。
[0020] 本发明根据瞬时转化的烟草病情指数的变化，选择核巧酸序列分别为SEQID No. 1、SEQIDNo. 4所示的AK两个DNA区段，用于Gateway干扰载体的构建。通过BP反应