一种具有杀线虫功能的刀孢轮枝霉基因工程菌株及其应用
【技术领域】
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[0001]本发明涉及一种具有杀线虫功能的刀孢轮枝霉基因工程菌株(Lecanicilliumpsall1tae AaIT)及其应用，属生物农药技术领域。
【背景技术】:
[0002]植物寄生线虫是世界范围内普遍发生的植物病害。据统计，全球每年因植物寄生线虫造成的直接经济损失高达1570亿美元，其中尤以根结线虫、胞囊线虫最为严重。在我国，植物寄生线虫危害蔬菜、粮食、烟草、油料、水果等几乎所有的农作物，对许多重要农作物的危害已经超过其它植物病害，且呈逐年增加的趋势。目前，我国对植物寄生线虫的防治主要依赖于化学农药。但化学农药在毒杀线虫的同时，对其他生物的高毒性，在农作物和土壤环境中的残留等，都严重影响食品安全与环境生态安全。随着经济发展，我国社会正由温饱型向全面小康型转变，人民生活也由吃饱向吃好转变，健康绿色食品是现代生活的基本需求。因此，研究开发生物杀线虫剂已经成为现代农业可持续发展中必须解决的关键问题。而利用线虫天敌对有害线虫进行生物防治逐渐受到人们的关注。尽管食线虫真菌作为重要的线虫生防资源已经得到广泛的研究和应用，但现有微生物杀线虫剂毒力有限、防效不稳成为建立作物病原线虫有效防控体系面临的主要难题。因此，通过增强杀线虫真菌的毒性，提高杀线虫真菌和细菌的杀线虫能力，构建高效线虫生防工程菌，成为有效控制病原线虫的新途径。
[0003]蝎子毒是一种神经毒素，能作为研究蛋白质的理想材料；由于蝎子毒素具有高度选择性和特异性，而且编码的基因较小，便于分子操作，因此是研究蛋神经生物学、免疫学、白质工程和离子通道的理想材料。近年来，已经有不少学者利用蝎子毒来开发新型生物杀虫剂。例如，Wang等曾将一种来自黄肥尾蝎(Androctonus australis)的昆虫特异性神经毒素(neurotoxin)AaIT转入金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)中，促进这种真菌杀虫剂的毒性。Lu等人2008年将蝎子毒基因AaIT成功转入昆虫病原真菌球孢白僵菌Beauveria bassiana中，同样大大提高了该菌对昆虫的毒杀作用。虽然将蝎子毒基因转入昆虫病原菌中提高昆虫病原菌对昆虫的毒性已经报道，而目前为止，尚无利用蝎子毒基因构建线虫生物防治工程菌株的报道。
[0004]在众多食线虫真菌中，轮枝霉(Lecanicillium)是一类非常重要的生物防治真菌资源，它们能寄生于游离线虫(内寄生)和固着线虫的卵、雌虫及胞囊。刀孢轮枝霉(Lecanicillium psall1tae)作为轮枝霉属中最为重要的食线虫真菌,具有极强的杀线虫效果。本发明以具有较好生防效果的刀孢轮枝霉作为出发菌株，运用原生质体转化技术将自于黄肥尾蝎的蝎毒素基因AaIT导入，得到具有更高杀线虫活性的工程菌株。
[0005]经文献检索，未见与本发明相同的公开文献报道。
【发明内容】
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[0006]本发明的目的在于提供一种具有杀线虫功能的刀孢轮枝霉基因工程菌株(Lecanicillium psall1tae AaIT)及其应用。
[0007]本发明通过对一株刀孢轮枝霉菌株进行基因改造，提高杀线虫活性，开发高效生物杀线虫制剂。本发明通过对刀孢轮枝霉菌株(中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)菌株号:CGMCC1312)进行基因工程改造，通过原生质体转化技术将来自于黄肥尾蝎的蝎子毒基因AaIT转入到刀孢轮枝霉菌株中，获得一株具有较高杀线虫活性的刀孢轮枝霉基因工程菌株(Lecanicillium psall1tae-AalT)。该工程菌株已于2014年12月5日保藏在中国典型培养物保藏中心；保藏单位地址:中国武汉市武汉大学；保藏号为CCTCCM 2014629。
[0008]插入的AaIT的基因序列如下:
[0009]CGGGATCCTGTTCATGGAACATCACACTCGCTGACTCTGGACACCAACTG TATTCACTCGCTAATTCGTTCCTGGCTCAAATTCTTTTCCGTTCCCTAGACCAT CATGCGTGAACTTTCTTCGGTTCTCGCCCTTTCGGGCTTGCTGGCCCTGGCGTC GGCAAAGAAGAACGGCTACGCCGTCGATAGCAGCGGCAAGGCCCCCGAGTGC CTGCTGAGCAACTACTGCAACAACCAGTGCACCAAGGTCCACTACGCCGATA AGGGCTACTGCTGCCTGCTGAGCTGCTACTGCTTCGGCCTGAACGATGATAAG AAGGTCCTGGAGATCAGCGATACCCGTAAGAGCTACTGCGATACCACCATCATCAACTAAGGATCCCG.
[0010]其中:
[0011 ] GGATCC部分为BamHI内切酶酶切位点；
[0012]TGTTCATGGAACATCACACTCGCTGACTCTGGACACCAACTGTATTCACT CGCTAATTCGTTCCTGGCTCAAATTCTTTTCCGTTCCCTAGACCATC 部分为启动子；
[0013]ATGCGTGAACTTTCTTCGGTTCTCGCCCTTTCGGGCTTGCTGGCCCTGGCG TCGGCA 部分编码AaIT的信号肽；
[0014]AaIT的氨基酸序列如下:
[0015]MRELSSVLALSGLLALASAKKNGYAVDSSGKAPECLLSNYCNNQCTKVHYA DKGYCCLLSCYCFGLNDDKKVLEISDTRKSYCDTTIIN.
[0016]其中:MRELSSVLALSGLLALASA部分为 AaIT 的信号肽。
[0017]本发明的具有杀线虫功能的食线虫真菌刀孢轮枝霉基因工程菌株(Lecanicillium psall1tae AaIT)在制备用于防治秀丽隐杆线虫制剂中的应用。
[0018]本发明的有益效果在于:
[0019]刀孢轮枝霉基因工程菌株(Lecanicillium psall1tae AaIT)较野生型出发菌株具有更高的杀线虫活性。当菌株培养在固体CMA培养基上时，基因工程菌对线虫的致死率在36小时达95%以上，而菌株的发酵液在36小时对线虫的致死率达到94%，能够在制备杀线虫制剂中应用。
【附图说明】:
[0020]图1显示刀孢轮枝霉出发菌株和工程菌菌株以及它们的发酵液在12小时，24小时和36小时对秀丽隐杆线虫的致死率的比较。其中:
[0021]图1(a)显示CMA平板上，刀孢轮枝霉基因工程菌株与野生型菌株在12小时，24小时和36小时对秀丽隐杆线虫的致死率；
[0022]图1 (b)显示刀孢轮枝霉基因工程菌株与野生型菌株发酵液在12小时，24小时和36小时对秀丽隐杆的致死率。【具体实施方式】:
[0023]以下结合附图对本发明作详细描述，但本发明的内容并不局限于此。
[0024]一、刀孢轮枝霉基因工程菌株(Lecanicillium psall1tae AaIT)构建方法
[0025]1.构建基因转化载体；
[0026]载体的构建方法如下:用引物AaIT-f和AaIT-r扩增得到蝎子毒基因AalT，同时在5’端和3’端引入BamHI酶切位点。用限制性内切酶BamHI将载体ρΑΝ52_1Ν切开，用连接酶将扩增得到的AaIT片段与线性化的ρΑΝ52-1Ν进行连接，构建得到pAN52_AaIT转化载体。
[0027]用来扩增AaIT基因383bp片段的相关引物如下:
[0028]AaIT-f:5’ -CGGGATCCTGTTCATGGAACATC-3，;下划线表示在该基因片段 5’ 端引入BamHI酶切位点
[0029]AaIT-r:5’ ~CGGGATCCGCGGCCGCTTAGTTGA~3，;下划线表示在该基因片段 3’ 端引入BamHI酶切位点
[0030]2.转化原生质体
[0031]2.1原生质体的制备方法
[0032]I)将出发菌株刀孢轮枝霉接种到PDA或OA平板上，放置于28°C恒温箱中培养8d后，取直径0.5cm的菌丝圆片(最好取菌落边缘的菌丝块)，接种于100ml TG液体培养基中，28°C，145rpm 摇瓶培养 24_36h ；
[0033]2)用灭过菌的垫有6层擦镜纸的漏斗过滤收集养好的菌丝，并用灭菌水洗涤2次菌丝体，再用丽buffer洗涤菌丝2次。
[0034]3)将收集的0.5g菌丝体悬浮于1ml细胞壁降解酶液中(MN溶液中含有过滤除菌的 10mg/ml snailase 和 10mg/ml cellulase,)中，30°C，160rpm 酶解 3.5-4.5h,在此期间用显微镜镜检，观察裂解出来的原生质体的浓度；
[0035]4)用灭过菌的垫有4层擦镜纸的漏斗过滤去除未酶解掉的菌丝，然后将收集的含原生质体的溶液转移到1.5m