用于生物防控的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列及其载体和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于生物防控及线虫研究的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列及其载体与应用，本发明通过RNA-seq测序技术并结合生物信息学分析，第一次获得了较为完整的禾谷孢囊线虫侵染抗性植物时候的基因表达谱，并在相关数据库中找到了三条具有致死效应的RNAi特异位点序列，其序列为：RCCNY1：SEQ?ID?NO.1或RCCNY2：SEQ?ID?NO.2或RCCNY3：SEQ?ID?NO.3。
【专利说明】用于生物防控的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列及其载体和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物工程领域，特别涉及一种用于生物防控的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列及其载体和应用。
【背景技术】
[0002]禾谷孢囊线虫(及SPfiaae人又称燕麦孢囊线虫、禾谷孢囊线虫，对小麦、大麦、黑麦、燕麦及多种禾本科牧草具有严重危害性，是世界上广泛存在的病原线虫，尤其对小麦的生产构成严重的威胁。我国自1987年在湖北天门县发现该病害以来，迄今已在华北、西北、华中以及华东等13个省区市发现有分布，且有逐渐蔓延之势。目前的主要防治方法包括农业防治、化学农药防治和生物防治。长期以来我国农民主要采取轮作、灌溉、增施有机厩肥、深翻和日晒土壤、种植诱捕植物和调节播期等农业技术措施防治线虫，但是日常种植的作物基本上都是禾谷孢囊线虫的寄主，因而防治效果并不显著。化学农药防控线虫是有效的方法之一，但是它对环境和农产品造成的污染使得该方法缺陷凸显。而生物防治目前报道最多的是食线虫真菌和线虫天敌细菌，但因其效果不明显，商品化困难，至今尚没有一种生防制剂被广泛推广。因此，寻找安全而又行之有效的线虫防治途径非常必要。
[0003]RNAi 干扰(RNA interference, RNAi)是指由双链 RNA (double-strandRNA, dsRNA)在细胞内特异性地诱导与之同源互补的mRNA降解，使相应基因的表达关闭，从而引发的转录或转录后水平的基因沉默现象(post-transcript1nal genesilencing, PTGS) 0这种现象是生物为保护自身基因组免受外源(如病毒)和内源性(如转座元件)序列的侵袭，特异性地调节或干扰基因表达的一种自身防御“免疫”应答现象。
[0004]关于线虫研究中，已发现线虫体内存在着能把RNAi信号放大和传递的机制，微量的dsRNA就能引导机体产生强烈的RNAi效应，而且能够传递到子代。dsRNA可以通过微注射进入C.elegans成虫，也可以把C.elegans成虫浸泡在含有dsRNA的溶液中或者喂饲含有dsRNA的大肠杆菌。注射进入的dsRNA很容易在干细胞中扩散引起RNAi，而且能将这种效应传递到子代。这种方法产生的表型外显率高，非常适合胚胎基因的功能研究。然而注射法需要体外合成dsRNA和手工注射操作，费时、花费高而且技术难度大，很难用于大规模的功能分析。浸泡法是将线虫浸泡于高浓度的dsRNA溶液。相比注射法，浸泡法能够同时对大量的线虫材料进行处理。但是，浸泡法同样需要体外合成大量的dsRNA(—般为l-5mg/ml),成本很高。与注射法和浸泡法比较，喂饲法有其独特的优势。喂饲法通过构建特殊载体，细菌体内诱导表达dsRNA，再喂饲线虫，可以有效抑制靶标基因的表达，省钱省事，并且可大规模进行实验。因而，如果建立一个RNAi细菌喂饲文库，该方法就可高效地研究大批基因的功能，从而找出可用于农业生产中线虫的防治方法。
[0005]禾谷孢囊线虫与根结线虫同属于固着性内寄生线虫，与寄主建立寄生关系后雌虫固着在取食部位不再移动。由于不能在人工培养基上培养，所以直接在寄生线虫中应用RNAi技术比较困难。根结线虫体形小，微注射感染手段变得不再实用。另外，它们在感染寄主植物前不正常吸收液体也使得研究无法开展。因而，近几年的一项重大突破即是找到在植物寄生线虫上进行RNAi技术的方法。首次向植物寄生线虫成功注入dsRNA的是Urwin等应用章鱼胺刺激大豆胞囊线虫(Heterodea glycines)和马铃薯白线虫(Globoderapallida)的口腔，使其吸半胱氨酸蛋白酶、hgctl、精子主蛋白(MSP)三个基因的dsRNA。处理过的线虫侵染植物14天后分离，发现三个靶标基因的表达明显受到抑制，相应的表观遗传性状也发生了改变。经优化后，此方法也被用于根结线虫的研究。Bakhetia等把M.1ncognita幼虫浸泡在编码过氧化物酶(dual oxidase)的dsRNA中，结果在线虫侵入大豆35天后检测，总产卵量减少了 70%。Shingles等应用RNAi技术敲除M1-cpl-Ι基因，降低了其转录本丰度，M.1ncognita的J2s幼虫的半胱氨酸蛋白酶活性也降低了。几丁质合成酶是甘蓝根结线虫(Meloidogyne artiellia)生成卵壳几丁质的一种重要的酶。Fanelli等证明把卵块浸泡在几丁质合成酶dsRNA溶液中，可以使几丁质合成酶基因的表达减少，卵孵化延迟。另外，Rosso等研究发现，间苯二酹可刺激M.1ncognita对dsRNA的吸收，并且观察到了明显的RANi现象。除了离体干扰线虫以外，有些学者通过构建表达dsRNA的转基因植物达到减少根结线虫寄生的目的。Yadav等把RNAi用于转基因烟草成功地干扰了 M.1ncognita的生长发育,表明在寄主植物中表达dsRNA是一种控制寄生线虫病的可行策略。Huang等在拟南芥内过表达根结线虫寄生基因16D10，结果根结减少了63-90% ,而且体积很小，卵块的产量也减少了 69-93%，成功地减少了 4种根结线虫的寄生。Fairbairn等构建转基因烟草(Nicotiana tabacum)表达dsRNA发夹结构,沉默爪睡根结线虫(Melododogyne javanica)转录因子MjTisll。结果虽然没有明显减少线虫的繁殖量和卵的孵化率，但是证明植物可以作为一种传输体系诱导根结线虫RNAi介导的基因沉默。由上可以看出，利用RNAi转基因植物来防治寄生线虫是一个新的防治策略，将为植病防治工作带来新的前景。
[0006]但前述研究均是集中在模式动物秀丽线虫和植物寄生根线虫的相关研究，由于禾谷孢囊线虫的基因组背景尚未阐明，所以没有相关研究报道。随着近年来转录组测序技术的发展，利用基因组和转录组技术相结合来研究植物寄生性线虫的方法流行起来。利用转录组技术可以高通量的获得相关线虫的候选基因从而进一步鉴定相关功能基因。我们利用对禾谷孢囊线虫(H.avenae)和根结线虫(Meloidogyne naasi)具有双抗作用的材料易变山羊草的根部进行了深度的转录组测序。通过对测序结果进行分析，在去除了植物，微生物，细菌和载体序列后，首次得到了禾谷孢囊线虫在侵染抗性植物时表达的相关基因846条。进一步和已有的线虫数据库进行比对分析后，去除和植物(plant)，昆虫(insect)和人类(huma n)同源的基因,最后得到三条和秀丽线虫(C.elegans)同源又具有致死效应的基因。在此基础上构建了 dsRNA干扰载体，进行dsRNA浸泡干扰实验，最后发现三个基因位点均具有致死效应，其中两个基因具有显著致死效用。
【发明内容】
[0007]为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于生物防控的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列及其载体和应用。
[0008]为达到上述目的，本发明的技术方案为:
[0009]一种用于生物防控及线虫研究的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列，其序列为:RCCNYl:SEQ ID N0.1 或 RCCNY2:SEQ ID N0.2 或 RCCNY3:SEQ ID N0.3。
[0010]进一步的，所述干扰序列的构建方法为:选用具有CCN抗性和RKN抗性的易变山羊草I号作为转录组测序材料，之后通过RNA-Seq测序技术得到了第一个禾谷孢囊线虫侵染植物的转录组，进行转录组测序，并通过序列比对，基于线虫数据库找到了 36个禾谷孢囊线虫的RNAi干扰位点序列,通过进一步的筛选,排除了和植物(Plant)、昆虫(Insect)和人类(Human)同源的序列，最后得到了三个具有致死效应的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列。[0011 ] 一种RNA干扰载体，其特征在于，所述RNA干扰载体含有上述的RCCNYl或RCCNY2或RCCNY3的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列。
[0012]一种用于生物防控及线虫研究的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列在禾谷孢囊线虫研究及生物防控方面的应用。
[0013]相对于现有技术，本发明的有益效果为:本发明通过体外转录分别合成禾谷孢囊线虫(CCN)的靶标基因片段 RCCNYl (Unigene38116)、RCCNY2 (Unigenel02492)和RCCNY3 (Unigene38007)的dsRNA,然后通过浸泡法对禾谷孢囊线虫(CCN)的J2幼虫进行RNAi实验。本实验发现线虫长时间聚集容易死亡，采用摇床培养悬浮线虫溶液，大大改善了这一状况。结果发现dsRNA明显降低了幼虫的活性，说明靶标致死效应基因在线虫的生长发育中具有重要作用。
[0014]由此证明本发明采用转录组技术找到相关功能基因研究基因功能的方法切实可行，为大规模鉴定物种全基因组功能提供了新的思路，同时也首次较为系统的鉴定并筛选了禾谷孢囊线虫与抗性植物拮抗过程中表达的相关基因。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1.利用基因特异的干扰RNA喂饲线虫24h后线虫的存活率，dsRNA的浓度为25ng/yL，和对照相比较有显著差异的(p〈0.05)已用字母标出(a，b，c三组数据间存在显著性差异)。
[0016]图2为本发明3个禾谷囊胞线虫目的基因的dsRNA处理结果，其中，A:水、B:基因RCCNYl (Unigene38116)、C:基因 RCCNY2 (Unigenel02492)、D:基因 RCCNY3 (Unigene38007)。
[0017]图3为转录组测序Unigene序列比对路线图。
[0018]图4为基因RCCNYl (Unigene38116)测序图，结果显示测序序列和PCR序列完全—致。
[0019]图5为基因RCCN Y2 (Unigenel02492)，测序图结果显示测序序列和PCR序列完全一致。
[0020]图6为基因RCCNY3(Unigene38007)测序图，结果显示测序序列和PCR序列完全一致。
[0021]图7为基于转录组中的候选Unigene基因片段的PCR电泳图，其中，M:DNA 标记，1:基因 RCCNYl(Unigene38116)、2:基因 RCCNY2(Unigenel02492)、3:基因RCCNY3 (Unigene38007)、4:对照。
【具体实施方式】
[0022]下面结合附图及【具体实施方式】对本发明方案做进一步详细描述:
[0023]试验例:一、实验材料和试剂
[0024]1.供试线虫材料
[0025]禾谷孢囊线虫山东肥城群体(H.avenae,致病型pathotype Ha43)由山东农业大学刘峰教授提供。用采集受害的小麦根和根际土壤，取200ml 土壤于塑料盆中捻碎，用强水流冲洗，搅动，沉淀片刻，将水溶液过20和80目的网筛，重复以上步骤3次，再用小水流轻轻清洗80目筛残余物，用滤纸过滤，解剖镜下挑取健康可用的孢囊。
[0026]2.主要试剂和酶类
[0027]DNase I和RNaseH购自全式金公司；高纯度质粒提取试剂盒购自Promega ;RNaseInhibitor、LITMUS281载体、T7RNA聚合酶NTPmix购自NEB公司；梭甲基纤维素钠购自Sigma公司；Taq酶、DNA Marker、pGMTeasy连接试剂盒均为全式金公司产品；间苯二酹购自北京化学试剂厂。
[0028]二、分析及实验流程:
[0029]RNA-seq 测序:
[0030] 1.植物材料:选用具有CCN抗性和RKN抗性的易变山羊草作为转录组测序材料，以测定它在接种CCN处理和不接种CCN两种情况下根部所有基因的表达情况。首先将材料的种子进行表面灭菌处理(在3%浓度的次氯酸钠和0.01%的TWeen20混合液中浸泡5min后再用灭菌水浸泡3次，再将种子均匀铺陈在持续湿润的滤纸上置于5cm直径的培养皿中，在20°C左右的室温和16h/8h的光照周期环境下发苗。十天后将幼苗均分为两组:一组用于接种CCN的J2幼虫(每株接种1000条)，另一组不接虫而作为第一组的对照，同时将接种CCN 的时间点定义为 Oh/dpi (hours or days post inoculat1n, hpi or dpi)。30 个小时后(30hpi)，将所有植株转到无线虫和无菌的环境下以避免未侵入根部的CCN持续侵染，从而使得合胞体(syncytia)的发育同步化，同时确保周围环境为20°C左右的室温和16h/8h的光照周期以促使植株继续生长发育。
[0031]2.转录组测序:等量混合接种禾谷孢囊线虫和不接虫两种处理在接虫后30小时、3天和9天的根部RNA进行Illumina HiSeq?2000测序平台4G深度的转录组从头测序,运用两个组装程序对测序数据进行拼接。通过Trinity method获得了 118，064条独立基因(unigene)，其平均长度为500bp、N50为599bp、平均测序深度为33.25倍。进一步对这些独立基因进行了注解。
[0032]线虫序列筛选:
[0033]1.通过注解获得全部长度超过200bp的转录组数据库在
[0034]Swiss-prot/trEMBL蛋白数据库进行比对，以得分超过50 (bit score>50)为筛选得分临界值；
[0035]2.对公共数据库(NCBI dbEST)中可以下载的全部线虫表达
[0036]序列标签(Nematode EST)基于生活周期分为三类:自由线虫(FLN)、动物寄生线虫(APN)和植物寄生线虫(PPN)。将蛋白数据库比对后序列在线虫表达数据库中进行本地比对(tblastX)来进一步确定线虫相关基因，同时也通过核苷酸序列比对(blastN)和蛋白质序列比对(blastX)在Μ.incognita和Μ.hapla的基因组数据库中进行比对(genomeproject websites (http://www.1nra.fr/meloidogyne_incognita, http://www.hapla.0rg),以上比对结果均选择最佳比对值(Top hits)。
[0037]转录组测序Unigene序列比对路线如图4所示。
[0038]RNAi位点的发现:
[0039]1.把预测得到的线虫基因序列采用本地比对，基于秀丽线虫基数
[0040]据库WormBase (http://www.wormbase.0rg, release WS227),将最为相似的基因序列作为禾谷孢囊线虫候选基因保留下来；
[0041]2.将前述比对得到的基因和秀丽线虫的RNAi位点数据库相比较
[0042](WormMart sect1n of WormBase (release WS220)),选出可以对应到致死效应的位点的基因(比对得分临界值>40，bit scoreMO)；
[0043]3.将前述得到的RNAi位点序列以比对得分临界值>40 (bit scoreMO)为标准，进一步和植物的非冗余蛋白数据库相比较(plant nonredundant protein database,Embryophyta, NCBI txid3193),将比对不到(No hits)植物非冗余蛋白数据库的基因进一步和昆虫(insect)的非冗余蛋白数据库(nonredundant insect protein database (NCBItxid6960))及人类(human)的非冗余蛋白数据库(nonredundant human proteindatabase (NCBI txid9606))进行比对(得分临界值>40，bit scoreMO)，最后只将致死型RNAi (lethal RNAi)序列，同时又比对不到(No hits)植物、昆虫和人类非冗余蛋白数据库的基因序列作为候选的RNAi位点。
[0044]3.三个禾谷孢囊线虫基因部分片段的PCR扩增
[0045]a.弓丨物设计:
[0046]如表1所示，候选禾谷孢囊线虫转录组中具有致死效用基因序列及秀丽线虫中同源基因
[0047]
【权利要求】
1.一种用于生物防控及线虫研究的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列，其特征在于，其序列为:RCCNY1:SEQ ID N0.1 或 RCCNY2:SEQ ID N0.2 或 RCCNY3:SEQ ID N0.3。
2.根据权利要求1所述的一种用于线虫研究及生物防控的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列，其特征在于，所述干扰序列的构建方法为:选用具有CCN抗性和RKN抗性的易变山羊草I号作为转录组测序材料，之后通过RNA-seq测序技术得到了第一个禾谷孢囊线虫侵染植物的转录组，进行转录组测序，并通过序列比对，基于线虫数据库找到了 36个禾谷孢囊线虫的RNAi干扰位点序列，通过进一步的筛选，排除了和植物、昆虫和人类同源的序列，最后得到了三个具有致死效应的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列。
3.—种RNA干扰载体，其特征在于，所述RNA干扰载体含有权利要求1所述的RCCNYl或RCCNY2或RCCNY3的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列。
4.权利要求1所述的一种用于生物防控及线虫研究的禾谷孢囊线虫RNAi位点序列在禾谷孢囊线虫研究 及生物防控方面的应用。
【文档编号】C12N15/63GK104178490SQ201410406303
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年8月18日 优先权日:2014年8月18日
【发明者】余懋群, 郑明辉, 李林, 徐德林, 龙海, 潘志芬, 邓光兵 申请人:中国科学院成都生物研究所