专利名称：渤海湾杀线虫丝状海洋真菌枝顶孢霉的筛选及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于海洋生物资源及微生物菌种，具体体现在一种分离自渤海湾水域的杀线虫枝顶孢霉菌株UcreMWi^B cephalosporium) BH-0531及其筛选和应用。
背景技术：
线虫作为一类重要的病原物，它的危害已成为农林生产上的重要问题。全世界已报道的植物寄生线虫达200多属5000余种。植物寄生线虫病害给全世界农业每年带来近1250亿美元的经济损失，仅次于真菌病害。因此，治理土壤及植物寄生线虫已成为一个全球性的、迫切学要解决的重要问题。化学杀线剂，如40年代早期出现的溴甲烷，50年代后期出现氨基甲酸酯类和有机磷酸酯类等，多为有毒农药，被发现有致畸、致癌等剧毒作用，同时存在严重的3R问题抗药性、药物残留、害虫再猖撅。随着人类环保意识的增强，生物防治已成为线虫防治的主导。微生物是一类种类繁多的可再生资源，是最丰富的遗传基因库，也是植物病原线虫的重要天敌，以及次级代谢产物是生物活性物质的重要来源。目前开发的第一代线虫生防制剂主要是活菌体制剂，其中研究最多的生防因子包括捕食线虫真菌、内寄生真菌和寄生性细菌。但活菌体制剂由于土壤生态系统中的微生物区系之间存在着不同程度的相互抑制作用，导致活体生防菌在不同国家的不同类型土壤中防治效果的不稳定性和不一致性，使得其使用受到很大限制。真菌的次生代谢产物作为第二代线虫生防因子，以直接作用于农作物线虫的方式发挥作用，有着作用快、药效高、环境相容性好、不容易造成二次污染等优点。已发现的杀线虫活性代谢物进行统计有179种之多，包括生物碱类，多肽类，萜类，大环内酯类，氧杂环类，苯并类，醌类，脂肪类，简单芳香类等。但多停留于实验室研究阶段，且大多为水溶性较差的脂溶性物质，需要通过添加增效剂来助溶，这为实际应用造成了困难。因此，开发出高效、低毒、相对专一性以及廉价的微生物杀线剂，将会是今后的研究重点。海洋占地球总面积71%，地球生物80%生活在海洋。海洋特殊的环境空间造就了海洋生物独特的次级代谢循环，演化出了不同于陆生生物的遗传背景和代谢途径，是寻找新药或先导化合物的宝贵资源。c印halosporin C是最早从海洋真菌中分离到的抗生素，此后有关这方面的研究成指数增长，如澳大利亚Capon研究组从南澳大利亚海洋筛选出两株杀线虫海洋真菌Asper^iVAz1S caneus 和 Raspailia sp (Caponn RJ，2003)。肖永堂等(2005)对188株海洋真菌代谢物进行杀线虫毒力测定，毒力级别达到A级的菌株占1. 60% ；而死亡率达50%以上的菌株占总数的43. 1%。郑忠辉等(2005)对一株海洋真菌代谢物对小杆线虫作用现象进行观察，认为是一种神经毒剂。展示了海洋真菌在杀线虫领域的潜能。
发明内容
本发明的一个目的在于克服现有杀线虫剂中存在的不足和杀线虫剂高效生产菌种资源匮乏的问题，从而提供一株具有杀线虫功用的渤海湾杀线虫丝状海洋真菌枝顶孢霉菌株BH-0531菌株(保藏号CGMCC-5445)。本发明的另一个目的在于提供一种渤海湾杀线虫丝状海洋真菌枝顶孢霉菌株的筛选方法。本发明的还一个目的在于提供一种渤海湾杀线虫丝状海洋真菌枝顶孢霉菌株BH-0531菌株在制备作为生物活性物质用于农用杀虫剂、生物农药和抗生素发酵生产中的应用。为实现上述目的，本发明提供了如下的技术方案
一种渤海湾杀线虫丝状海洋真菌枝顶孢霉菌株(.Acremonium cephalosporium )BH-0531菌株，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC-5445。保藏时间2011-11_4。该菌种是由采自渤海的(经度E 117° 53' 23.2"，纬度N 38° 55' 51.0〃)底层海水样本中分离。菌落特征在查氏琼脂上7d直径33-35mm，14d达50-65 mm ；初始质地绒毡状；初生菌丝体白色，随培养时间延长呈浅黄至浅粉红色，由于大量孢子产生菌落质地成粉质状，菌落边缘近整齐；无渗出液；菌落反面呈浅橘或黄色。菌丝特征有隔，较细，直径(2.0士 μ m)；分生孢子梗从菌丝生出，直立，短小，末端渐细，顶端球形，生分生孢子无隔、多为椭圆形，长轴直径3. 0 4. 0 μ m，短轴直径2. 1士 μ m，壁近于光滑。枝顶孢霉BH-0531菌株隶属于枝顶孢霉属Ucremonium ；旧称头孢霉属，Cephalosporium.)。该菌株具有在海水培养基和不含海水的查氏、PDA等培养基上生长，并产生杀线虫等活性物质的性能，所产生的活性物质杀线虫活性高，还可抑制真菌和细菌的生长。因此可应用于杀线虫生防制剂、生物农药和抗生素等发酵生产领域。本发明所述的筛选指的是以线虫的死亡率为指标对菌株的杀线虫能力进行评价。本发明进一步公开了渤海湾杀线虫丝状海洋真菌枝顶孢霉菌株BH-0531的筛选方法，其特征在于
(1)菌种的分离、纯化
样本来自渤海湾的底层海水，经孔径0.45 μ m硝酸纤维素滤膜(f50)过滤后，将滤膜置于海水固体培养基上，于沈！恒温培养获得菌落，采用挑单孢法，将其转入新的平板培养，此过程反复进行，直至菌落纯化为止；所述的海水固体培养基葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母膏 2g/L，海水 600mL/L，蒸馏水 400mL/L，琼脂 20 g/L ；
(2)菌种的筛选
1)将上述分离纯化的菌种接种于液体培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵培养后的培养液经孔径为0. 22Mffl滤膜过滤，收集得到发酵滤液；其中所述的液体培养基是指查氏液体培养基=NaNO3 2 g/L, K2HPO4 1 g/L, KCl 0. 5 g/L, MgSO4 0. 5 g/L, FeSO4 0. 01 g/L，蔗糖 30g/L, PH 自然；
或海水液体培养基葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母膏2g/L，海水600mL/L，蒸馏水400mL/L ；
培养条件为接种量2 X IO6的孢子悬液，转速120r/min，初始pH6. 5J6°C发酵96h ；
2)使用M孔细胞培养板，在每孔中加入ImL发酵滤液和100μ L线虫悬液(平均1500头线虫/100 μ L)，^TC静置3d，5d后，解剖镜下统计线虫死亡率；分离筛选后获得具有杀线虫功用的来自渤海湾杀线虫丝状海洋真菌枝顶孢霉菌株BH-0531，其毒力级别达到死亡率彡90%的A级；
(3)菌种培养条件的优化
优化的培养基为去皮马铃薯150g/L，葡萄糖10g/L，酵母膏2g/L，海水含量600ml/L ； 其中去皮马铃薯150g/L指的是去皮马铃薯150g置400mL蒸馏水中煮汁，取汁液，再定容至 400mL ；
优化的培养条件为接种量2X IO6的孢子悬液，转速120r/min，初始pH6. 5J6°C发酵 96h ；培养得到杀线虫丝状海洋真菌枝顶孢霉菌株。本发明所述及的筛选是指利用线虫死亡率作为指标，通过对菌株的杀线虫能力进行评价，以线虫死亡率高(死亡率> 90%)为标准实施筛选，所述线虫为松材线虫(由中国农科学院植保所提供)。本发明从渤海水域分离得到并证实具有杀线活性的BH-0531菌株就是在这种背景下利用线虫死亡率作为指标，通过实验对发酵影响较大的PH值、接种量、培养温度、 培养时间等培养条件和碳氮源及其含量进行优化而获得的。其杀线活性达到A级90%)，可用不含海水的培养基培养，适用于常规发酵设备。该菌产生的杀线虫物质为中性、水溶性、耐热活性物质，分子量<6000 D0该物质还被证实具有抑制酵母菌和细菌的抑菌作用。菌株经经典分类指标的观察鉴定及ITS序列分析确定为 Acremonium cephalosporium. BH-0531。本发明进一步公开了渤海湾杀线虫丝状海洋真菌枝顶孢霉菌株BH-0531菌株在制备作为生物活性物质用于农用杀虫剂、生物农药和抗生素发酵生产中的应用。其中所述的农用杀虫剂、生物农药和抗生素对象为植物病原线虫、植物病原真菌和植物病原细菌。本发明更加详细的说明如下 一、具体技术支撑
㈠微生物名称和保藏情况
枝顶孢霉BH-0531菌株。该菌种在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC-5445，保藏时间2011_11_4。㈡菌株的生物学特性及鉴定
1.枝顶孢霉BH-0531菌株的形态学特征
菌落特征在查氏琼脂上7d直径33-35mm，14d达50-65 mm ；初始质地绒毡状；初生菌丝体白色，随培养时间延长呈浅黄至浅粉红色，由于大量孢子产生菌落质地成粉质状， 菌落边缘近整齐；无渗出液；菌落反面呈浅橘或黄色。菌丝特征有隔，较细，直径(2.0士 μ m)；分生孢子梗从菌丝生出，直立，短小， 末端渐细，顶端球形，生分生孢子无隔、多为椭圆形，长轴直径3. 0 4. 0 μ m，短轴直径 2. 1士 μ m，壁近于光滑。依据《菌物学大全》(裘维蕃，菌物学大全[M].北京科学出版社，1998:890) 和《常见与常用真菌》(中国科学院微生物研究所[M].北京科学出版社，1973)，该菌特征与枝顶孢霉特征相符，极似《常见与常用真菌》中所描述的顶头孢霉 acremonium.)。2. 18S rDNA ITS序列分析及鉴定结果测序结果连接产物经转化后测序，由北京华大基因科技序列测定片段长度约为500bp，测序结果如下
GGCAAAGGAGTCACTCCAACCCCTGTGACATACCTATGTTGCTTCGGCGGGCCGTCCCGCGGCGCGCCCACGTGGCGTGACCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGGGACCCAAACTCTTGCCTTTTTAGTGTCTCCTCTGAGTGGCATAAGCAAAAATAAACAAAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCATTTCAACCCTCAGCCCCCGTTCGCGGGGCGCTGGCGTTGGGGATCGGCCGTCCTCGCGGCGGCCGGCCCCGAAACACAGTGGCGGTCTCCTGCAGACTCCCCTGCGTAGTAGCACTACCTCGCAGAAGGGACGAGCGGGCTGGCCACGCCGTAAAACCCCCAACTTCTCCAGGTTGACCTCAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGGCGGAGGAA
序列提交到Gen-Bank数据库，进行BLAST比对，结果显示该菌株ITS序列与Acremonium sp. NJM 0672、Acremonium sp. NJM 0567 同源性为 100% (两者均分离于日本海域真菌感染的虾蛄体内)；与Emericellopsis maritima strain、 Emericellopsismaritima strain、Emericellopsis sp. r454、Emericellopsis sp. s030 同源性为 99%(Emericellopsis为已发现具有有性阶段的Acremonium种类)。结合形态学鉴定结果，将该菌确定为枝顶孢霉 BH-0531 (Acremonium cephaIosporium) ㈢菌种的分离、筛选1.菌种的分离、纯化
采自渤海(经度E 117° 53' 23.2〃，纬度N 38° 55' 51.0")底层海水的样本经0.45 μ m硝酸纤维素滤膜(f50，市售)过滤后，将滤膜置于海水固体培养基上，于260C恒温培养。采用挑单孢法，将其转入新的平板培养。此过程反复进行，直至菌落纯化为止。所述的海水固体培养基葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母膏2g/L，海水600mL/L，蒸馏水 400mL/L，琼脂 20 g/L。2.菌种的筛选(2)菌种的筛选
1)将上述分离纯化的菌种接种于液体培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵培养后的培养液经孔径为0. 22Mffl滤膜(市售)过滤所收集的滤液即为发酵滤液；
其中所述的液体培养基是指查氏液体培养基=NaNO3 2 g/L, K2HPO4 1 g/L, KCl 0. 5 g/L, MgSO4 0.5 g/L, FeSO4 0.01 g/L，蔗糖30 g/L，PH自然；或海水液体培养基葡萄糖IOg/L，蛋白胨2g/L，酵母膏2g/L，海水600mL/L，蒸馏水400mL/L ；
2)使用M孔细胞培养板，在每孔中加入ImL发酵滤液和100μ L线虫悬液(平均1500头线虫/100 μ L)，^TC静置3d，5d后，解剖镜下统计线虫死亡率；分离筛选后获得具有杀线虫功用的来自渤海湾水域的杀线虫枝顶孢霉菌株BH-0531，其毒力级别达到死亡率>90% A的级；培养条件为转速120r/min，初始pH6. 5J6°C发酵96h。该菌种已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC-M45。3.培养条件的优化
63. 1初始pH对产生杀线虫活性物质产生的影响结果如表1所示，结果表明初始PH值在6. 5以下时产物活性随pH值升高而升高，pH为6. 5到7. 5时达到活性较高并且相对稳定，PH到8后产物活性又有下降。 表1初始pH对菌株生长和杀线虫活性物质形成的影响
初始PH值菌体干重(g/L)3d后线虫死亡率(％)5d后线虫死亡率(％)42. 4±0. 261. 0774. 364. 53. 3±0. 261. 1274. 5853. 3±0. 266. 6775. 125. 53. 4±0. 274. 6479. 5663. 7±0. 283. 6588. 776. 53. 9±0. 285. 5093. 5573. 4±0. 285. 8793. 177. 53. 0±0. 290. 1095. 6182. 9±0. 275. 9686. 358. 52. 8±0. 264. 3275. 8392. 5±0. 249. 3260. 28对照1. 413. 25
3. 2溶解氧对BH-0531菌株生长和产生杀线虫活性物质产生的影响
通过采用不同的摇床转速和不同的装液量研究溶解氧对BH-0531菌株生长和杀线虫
活性物质形成的影响。结果如表2、表3所示
表2摇床转速对菌株生长和杀线虫活性物质形成的影响
权利要求
1.一种渤海湾杀线虫丝状海洋真菌枝顶孢霉菌株(JcreMWiWB cephalosporium) BH-0531菌株，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为 CGMCC-5445。
2.—种权利1所述渤海湾杀线虫丝状海洋真菌枝顶孢霉菌株BH-0531的筛选方法，其特征在于(1)菌种的分离、纯化样本来自渤海湾的底层海水，经孔径0.45 μ m硝酸纤维素滤膜(f50)过滤后，将滤膜置于海水固体培养基上，于沈！恒温培养获得菌落，采用挑单孢法，将其转入新的平板培养，此过程反复进行，直至菌落纯化为止；所述的海水固体培养基葡萄糖10g/L，蛋白胨 2g/L，酵母膏 2g/L，海水 600mL/L，蒸馏水 400mL/L，琼脂 20 g/L ；(2)菌种的筛选1)将上述分离纯化的菌种接种于液体培养基中进行摇瓶发酵培养，发酵培养后的培养液经孔径为0. 22Mffl滤膜过滤，收集得到发酵滤液；其中所述的液体培养基是指查氏液体培养基=NaNO3 2 g/L, K2HPO4 1 g/L, KCl 0. 5 g/L, MgSO4 0. 5 g/L, FeSO4 0. 01 g/L，蔗糖 30 g/L, PH 自然；或海水液体培养基葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母膏2g/L，海水600mL/L，蒸馏水 400mL/L ；培养条件为接种量2 X IO6的孢子悬液，转速120r/min，初始pH6. 5J6°C发酵96h ；2)使用M孔细胞培养板，在每孔中加入ImL发酵滤液和100μ L线虫悬液(平均1500 头线虫/100 μ L)，^TC静置3d，5d后，解剖镜下统计线虫死亡率；分离筛选后获得具有杀线虫功用的来自渤海湾杀线虫丝状海洋真菌枝顶孢霉菌株BH-0531，其毒力级别达到死亡率彡90%的A级；(3)菌种培养条件的优化优化的培养基为去皮马铃薯150g/L，葡萄糖10g/L，酵母膏2g/L，海水含量600ml/L ； 其中去皮马铃薯150g/L指的是去皮马铃薯150g置400mL蒸馏水中煮汁，取汁液，再定容至 400mL ；优化的培养条件为接种量2X IO6的孢子悬液，转速120r/min，初始pH6. 5J6°C发酵 96h ；培养得到杀线虫丝状海洋真菌枝顶孢霉菌株。
3.权利1所述渤海湾杀线虫丝状海洋真菌枝顶孢霉菌株BH-0531菌株在制备作为生物活性物质用于农用杀虫剂、生物农药和抗生素发酵生产中的应用。
4.权利2所述的应用，其中所述的农用杀虫剂、生物农药和抗生素对象为植物病原线虫、植物病原真菌和植物病原细菌。
全文摘要
本发明提供一种分离自渤海湾水域的枝顶孢霉菌株BH-0531及其筛选和应用。该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC-5445。该菌种由采自渤海湾底层海水的样本中分离，经筛选、鉴定获得。本发明分离筛选的BH-0531菌株属于枝顶孢霉属(旧称头孢霉属)具有海洋微生物的生长温度低和高盐条件下生长的特性，具有产生杀线虫活性代谢产物的能力，所产生的杀线虫物质具有很好的热稳定性和水溶性，实验条件下杀线虫活性可达94%以上，可用于杀线虫剂和抗生素等生物活性物质的发酵生产。
文档编号C12P1/02GK102559509SQ201110347979
公开日2012年7月11日 申请日期2011年11月7日 优先权日2011年11月7日
发明者冯欣, 史晓讯, 孙建华, 孙金生, 孟凡欢, 孟庆恒 申请人:天津师范大学