用于在丝状真菌中产生位点特异性突变的方法
【专利说明】用于在丝状真菌中产生位点特异性突变的方法
[0001] 对序列表的引用
[0002] 本申请包含一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。 发明领域
[0003] 本发明涉及用于提供一种位点特异性突变的感兴趣的变体多肽的方法。
[0004] 相关技术说明
[0005] 在感兴趣的多肽中产生定点突变的若干种方法，包括例如，重叠延伸拼接 PCR( "SOE-PCR"）或QuickChange?方法（Stratagene公司）是已知的。后者在线性PCR 反应中使用一组重叠诱变PCR引物来扩增甲基化的双链质粒模板，随后是片段自连，其中 在执行PCR反应后且在将该连接混合物转化进大肠杆菌宿主中前，使用Dpnl核酸酶来去除 甲基化的模板质粒。然而，持续需要改进转化和选择效率，尤其在丝状真菌宿主内。
[0006] 发明概述
[0007] 本发明提供了在一种有待直接地转化进丝状真菌宿主中的编码感兴趣多肽的基 因中产生定点突变的方法，其中不需要依靠中间宿主如大肠杆菌来产生充足的遗传材料以 成功地转化该真菌宿主。这些方法涉及使用被特异性甲基化的常染色体复制型质粒，该常 染色体复制型质粒包括在PCR反应中作为模板的编码基因与一对非重叠端对端引物（其中 至少一个引物是诱变的），接着去除甲基化的模板DNA，自连以再环化这些PCR片段并指导 将产生的再环化载体转化至选择的丝状真菌表达宿主中，其中将这些引物在PCR反应前磷 酸化或者该产生的PCR片段在连接步骤前或期间磷酸化以便能够成功地连接。
[0008] 相应地，在第一方面，本发明涉及一种提供位点特异性突变的变体多肽的方法，该 方法包括下述步骤：
[0009] a)提供一种甲基化的模板常染色体丝状真菌复制型双链环状DNA载体，该甲基化 的模板常染色体丝状真菌复制型双链环状DNA载体包括一种编码亲本多肽的亲本多核苷 酸；
[0010] b)提供一对针对该亲本多核苷酸的端对端非重叠PCR引物，一个5'正向引物和另 一个3'反向引物，其中至少一个引物是诱变的；
[0011] c)用该PCR引物对进行该模板载体的PCR扩增以产生全长的载体突变的PCR片 段；
[0012] d)用适合的甲基化特异性核酸酶去除该模板载体；
[0013] e)通过自连环化这些突变的PCR片段；并且
[0014] f)将这些环化的突变的PCR片段直接转化至丝状真菌宿主细胞中以表达这些变 体多肽，
[0015] 其中将这些PCR引物在该PCR扩增前磷酸化，或者将这些PCR片段在该自连步骤 前或期间磷酸化，以便允许这些引物的端对端连接以环化这些突变的PCR片段。
[0016] 附图简要说明
[0017] 图1示出了实例1中使用的模板质粒PENI4286的示意图。
[0018] 图2示出了被用来验证实例1中产生的PCR片段大小的琼脂糖凝胶的图片。
[0019] 图3示出了被用来验证通过所声称的定点诱变方法成功地去除糖基化位点的在 实例1中使用的SDS-PAGE凝胶的图片。在实例的结尾中讨论该凝胶的细节。
[0020] 定义
[0021] cDNA:术语"cDNA"意指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分 子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。 早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的 步骤进行加工，包括剪接。
[0022] 编码序列：术语"编码序列"意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编 码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子（如ATG、 GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子（如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种 基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
[0023] 端对端非重叠PCR引物：该术语意指一对PCR引物，一个5'正向引物和一个3'反 向引物，其靶向双链环状DNA载体模板上的一个连续的多核苷酸区域，在该模板中当每个 引物都退火到其模板链时，这些引物端对端排成一行，在它们之间没有任何碱基对重叠。以 此方式，这两个引物将各自代表完全扩增的双链载体PCR片段的末端，如果将这些引物在 PCR扩增前磷酸化，或者将PCR片段在连接前或期间磷酸化，这些末端可以被连接在一起以 再环化载体。当这些端对端非重叠PCR引物中的至少一个是诱变的，S卩，它包括至少一个核 苷酸，其不同于所述诱变引物靶向的模板多核苷酸区域，则那个突变将被掺入进产生的扩 增PCR片段中。
[0024] 甲基化的模板常染色体丝状真菌复制型双链环状DNA载体：该术语意指一种常规 的双链环状DNA载体，S卩，一种质粒，其是甲基化的、常染色体的并且在丝状真菌宿主细胞 中能够独立复制，例如，凭借包含"自主复制序列"或ARS，诸如，众所周知的AMAl序列。
[0025] DNA甲基化：DNA甲基化是一个生化过程，其对于高等生物中的正常发育是重要 的。它涉及将甲基添加至胞嘧啶嘧啶环的5位或腺嘌呤嘌呤环的6号氮（胞嘧啶和腺嘌呤 是4种DNA碱基中的2种）。通过细胞分裂可以遗传这种修饰。腺嘌呤或胞嘧啶甲基化是 许多细菌的限制修饰系统的一部分，其中特异性DNA序列在整个基因组中被周期性地甲基 化。甲基化酶是识别特异序列并将该序列中或靠近该序列的碱基中的一种甲基化。被引入 至该细胞中的外源DNA(其不是以这种方式被甲基化）被序列特异限制性内切酶降解并切 害J。细菌基因组DNA不被这些限制性内切酶识别。天然DNA甲基化作为一种原始的免疫系 统起作用，从而允许该细菌自我保护以防止被噬菌体侵染。大肠杆菌DNA腺嘌呤甲基转移 酶（Dam)是一种~32kDa的酶。大肠杆菌Dam的靶识别序列是GATC，因为甲基化出现在这 个序列中的腺嘌呤的N6位（GmeATC)。
[0026] 甲基化特异性核酸酶：如上所述，腺嘌呤或胞嘧啶甲基化是许多细菌的限制修饰 系统的一部分，其中特异性DNA序列在整个基因组中被周期性地甲基化。另一方面，IM类 型限制性内切核酸酶能够识别并切割甲基化的DNA。DpnI是来自肺炎双球菌G41的甲基 化特异性核酸酶，其识别由Dam甲基化酶在这个序列中的腺嘌呤的N6位甲基化的序列（G meATC)〇
[0027] 控制序列：术语"控制序列"意指对于表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必 需的核酸序列。各个控制序列可以相对于编码多肽的多核苷酸是天然的（即，来自相同基 因）或外源的（即，来自不同基因），或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括 但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至 少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编 码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提 供有多个接头。
[0028] 表达：术语"表达"包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修 饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
[0029] 表达载体：术语"表达载体"意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码多肽的多 核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。
[0030] 宿主细胞：术语"宿主细胞"意指任何细胞类型，该细胞类型对于用包含本发明的 多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等是易感的。术语"宿主细胞"涵 盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
[0031] 分离的：术语"分离的"意指处于自然界中不出现的形式或环境中的物质。分离的 物质的非限制性实例包括（1)任何非天然发生的物质，（2)包括但不限于任何酶、变体、核 酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所 有天然发生的成分中去除；（3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或（4)通 过增加该物质相对于与其本质相关的其他组分的量而修饰的任何物质（例如，编码该物质 的基因的多拷贝；使用比编码该物质的基因本质相关的启动子强的启动子）。一种分离的 物质可以存在于发酵液样品中。
[0032] 核酸构建体：术语"核酸构建体"意指单链或双链的一种核酸分子，该核酸分子是 从天然发生的基因中分离的，或者以一种本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸 的区段，或者是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。
[0033] 可操作地连接：术语"可操作地连接"意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核 苷酸的编码序列安置在适当位置处，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。
[0034] 序列一致性：两个氨基酸序列之间或者两个核苷酸序列之间的关联度通过参数 "序列一致性"来描述。
[0035] 出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施（Needleman-Wunsch)算法（尼德曼和翁 施，1970,分子生物学杂志（J.Mol.Biol. )48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列 一致性，该算法是如EMBOSS软件包（EMBOSS:欧洲分子生物学开放软件套件（TheEuropean MolecularBiologyOpenSoftwareSuite)，赖斯（Rice)等人，2000,遗传学趋势（Trends Genet. ) 16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本）的尼德尔（Needle)程序所实施的。使用 的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0. 5,以及EBL0SUM62 (BL0SUM62的EMBOSS版 本）取代矩阵。尼德尔标注的"最长的一致性"的输出（使用-非简化选项获得）被用作 百分比一致性，并且如下计算：
[0036] (一致的残基X100V(比对长度-比对中的空位总数）
[0037] 出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法（尼德曼和翁施，1970,同上）确定两 个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性，该算法是如EMBOSS软件包（EMBOSS:欧洲分子 生物学开放软件套件，赖斯等人，2000,同上）（优选5. 0. 0版或更新版本）的尼德尔程序 所实施的。使用的这些参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0. 5,以及EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版本）取代矩阵。尼德尔标注的"最长的一致性"的输出（使用-非简化 选项获得）被用作百分比一致性，并且如下计算：
[0038]