专利名称：一种对潮湿遗址环境丝状真菌的生长抑制方法
技术领域：
本发明涉及一种丝状真菌的生长抑制方法，尤其是一种潮湿环境下丝状真菌的生长抑制方法。
背景技术：
丝状真菌的菌丝呈长管、分枝状，宽度2 10微米，可自前端生长并分枝，无横隔壁，具多个细胞核，并往往能形成分枝繁茂的菌丝体，但又不象蘑菇那样产生大型的子实体。在潮湿温暖的地方，很多物品上长出一些肉眼可见的绒毛状、絮状或蛛网状的菌落，就是丝状真菌。丝状真菌常用孢子的颜色来称呼，如黑霉菌、红霉菌或青霉菌。一般通过合成抑菌剂来对环境中的丝状真菌进行生长控制。这种方式会对自然环境造成损害。对于一些潮湿遗址环境，如水下遗址等，由于其环境十分适合丝状真菌的生长，而丝状真菌的无序生长将破坏遗址的原貌，特别是一些有机质丰富的地区，遗址微生物侵害尤其严重。这种潮湿遗址环境无法使用合成抑菌剂，因此，缺乏一种安全有效的丝状真菌防治途径。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种适应于潮湿遗址环境应用的丝状真菌生长抑制方法，利用几丁质酶和葡聚糖酶的复合协同作用，更能有效地抑制丝状真菌的生长发育，同时不会对环境造成二次污染和破坏。本发明的具体技术方案是:一种对潮湿遗址环境丝状真菌的生长抑制方法，包括以下步骤:步骤一，采样，将被测环境目标样本进行无菌采样；步骤二，孢子悬液的制备，将供试菌株接种在PDA培养基斜面上，置于28°C恒温培养箱内培养5d-7d后，用无菌生理盐水将成熟的孢子洗下，孢子原液用无菌脱脂棉进行过滤，在孢子滤液中加入无菌玻璃珠后置摇床振荡5分钟，用血球计数板计算孢子数量并调节孢子浓度在102-103个/ml，备用；步骤三，将葡聚糖酶2g溶于5ml pH=6的0.lmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液，用
0.45 μ m的超滤膜过滤除菌，将15ml培养基倾入平皿，冷却制成平板后，吸取几丁质酶液200u酶液涂布于培养基上，随之加入IOOOu 2000u的葡聚糖酶涂布于培养基上，静置片刻后将供试菌种的孢子悬液0.1ml涂布于培养基上，28°C，培养3d 5d，观察生长情况并计数。所述被测环境目 标样本包括空气、土壤、独木舟和墙体；空气采样采用仪器法即撞击式空气微生物采样器，采样高度距离地面1.0m
1.2m，采集的培养基平板运送到实验室后直接放入28°C培养箱中培养48h-96h后分离、鉴定;土壤采样用无菌金属小勺采集表层土壤3g 5g装入无菌玻璃试管中；
独木舟采样用无菌金属小勺刮取少许独木舟软腐木，装入无菌玻璃试管中；采集的土壤样本和软腐木样本运送到实验室后在无菌条件下分别称取Ig放入装有99ml灭菌生理盐水并带玻璃珠的三角烧瓶中，振荡30分钟，静置后，取Iml并注入9ml灭菌生理盐水，振摇试管，混合均匀，并做10倍递增稀释，分别取不同稀释度的样品液0.1ml于培养基平板，用无菌玻璃三角刮棒涂布于培养基表面；字幕墙采样:用10 X IOcm2灭菌板置于字幕墙处，用浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子I支，在灭菌板内横竖来回涂抹，并随之转动棉拭子，剪去手接触部分，将棉拭子放入装有IOml采样液的试管中待运送到实验室后在无菌条件下取ImL并注入9ml灭菌生理盐水，振摇试管，混合均匀，并做10倍递增稀释，分别取不同稀释度的样品液0.1ml于培养基平板，用无菌玻璃三角刮棒涂布于培养基表面。所述被测环境目标样本为字幕墙时，可采用200u几丁质酶+2000U葡聚糖酶涂抹去除丝状真菌。所述被测环境目标样本为独木舟时，用200u几丁质酶+IOOOu葡聚糖酶涂抹去除
丝状真菌。
具体实施例方式萧山跨湖桥遗址地处浙江省杭州市，位于钱塘江南岸萧山区湘湖景区，距今7000 - 8000年，为我国长江流域最早的新石器时代遗址之一，文化内涵十分丰富。由于遗址展示厅位于湘湖(为萧山区的备用水源)水下6-8米，常年处于高湿度环境(相对湿度在70% -100%)，加之遗址土壤中含海洋无机盐和动植物遗存的有机质非常丰富，致使遗址微生物危害十分严重，考虑到遗址环境的特殊性，我们摈弃了合成抑菌剂，选用生物酶进行试验，探索适合土遗址的安全有效的微生物防治途径，本项研究旨在为我国南方潮湿地区土木结构遗址的可持续性保护提供科学依据。材料与方法试验材料(1)生物酶:几丁质酶(Chitinase, from Strepto-myces griseus) 518units/g ；葡聚糖酶(Dextranase, from Penicillium sp.)25.3u/mg。西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司生产。(2)马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):马铃薯200克；葡萄糖20克；琼脂15克；蒸馏水I升；pH6.0。试验设备( 1)撞击式空气微生物采样器JWL-6型六级；(2 )电热恒温水浴槽DK-S25 (室温 95 °C )(3)生物安全柜 Hfsafe-12OO ；(4)生化培养箱 LRH-250A 15 40°C ± 1°C(5)生物显微镜 Olympus BX41TF 1000X试验方法 采样及样本处理空气采样:采用仪器法(撞击式空气微生物采样器)，采样高度距离地面1.0m 1.2m。采集的培养基平板运送到实验室后直接放入28°C培养箱中培养48h-96h后分离、鉴定。土壤采样:用无菌金属小勺采集表层土壤3g 5g装入无菌玻璃试管中。独木舟采样:用无菌金属小勺刮取少许独木舟软腐木，装入无菌玻璃试管中。采集的土壤样本和软腐木样本运送到实验室后在无菌条件下分别称取Ig放入装有99mL灭菌生理盐水并带玻璃珠的三角烧瓶中，振荡30分钟，静置后，取ImL并注入9mL灭菌生理盐水，振摇试管，混合均匀，并做10倍递增稀释。分别取不同稀释度的样品液0.1mL于PDA平板,用无菌玻璃三角刮棒涂布于培养基表面，培养方式同空气米样。字幕墙采样:用10 X IOcm2灭菌板置于字幕墙处，用浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子I支，在灭菌板内横竖来回涂抹，并随之转动棉拭子，剪去手接触部分，将棉拭子放入装有IOmL采样液的试管中待运送到实验室后在无菌条件下取ImL并注入9mL灭菌生理盐水，振摇试管，混合均匀，后面操作同土壤采样。丝状真菌的分离、鉴定培养基平板菌落长成后，选择不同菌落进行分离、纯化。采用点植法和载玻片培养法，根据菌落生长速度、菌落和培养基颜色变化、表面质地、渗出物等，并结合显微镜下观察的菌丝形状、孢子梗特征、孢子着生方式和孢子形态等，对分离、纯化的菌株作进一步的分类、鉴定。抑菌试验孢子悬液的制备将供试菌株接种在PDA斜面上，置于28°C恒温培养箱内培养5d_7d后，用无菌生理盐水将成熟的孢子洗下，孢子原液用无菌脱脂棉进行过滤，在孢子滤液中加入无菌玻璃珠后置摇床振荡5分钟，用血球计数板计算孢子数量并调节孢子浓度在102-103个/mL，备用。生物酶处理试验I)几丁质酶处理:将几丁质酶IOg溶于5mL0.lmol/L磷酸钾缓冲液(pH6),用0.45 μ m的超滤膜过滤除菌。将15mL培养基倾入平皿，冷却制成平板后，分别吸取0.05mL(处理①)、0.1mL (处理②)和0.2mL (处理③)酶液涂布于培养基上，静置片刻后将供试菌种的孢子悬液0.1mL涂布于PDA平板，28°C，培养3d 5d，观察生长情况并计数。2)复合酶处理:将葡聚糖酶2g溶于5mL0.lmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液(pH6)，用0.45 μ m的超滤膜过滤除菌。将15mL培养基倾入平皿，冷却制成平板后，分别吸取0.05mL(500u),0.1mL (IOOOu)和(λ 2mL (2000u)酶液涂布于培养基上，随之加入几丁质酶液，加入量根据不同试验菌单一酶处理效果不明显的浓度，静置片刻后操作同上。丝状真菌的鉴定结果丝状真菌的鉴定结果见表I。从表I可见空气中主要的丝状真菌有:黑曲霉(AspergiIIusniger, )、土曲霉(Aspergillus terreus)、展青霉(Penicillium patulum)和圆弧青霉(Penicilli umcyclopium)。土壤中主导菌为黑曲霉(Aspergillus niger, )、土曲霉(Aspergillus terreus)、聚多曲霉(Aspergillus sydowii )、杂色曲霉(Aspergillusversicolor)、圆弧青霉(Penicilliumcyclopium)、展青霉(Penicillium patulum)、黑青霉(Penicillium nigricans)、宛氏拟青霉(Paecilomyces varioti )和枝抱霉(Cladosporium)o字幕墙侵染菌为杂色曲霉(AspergiIIusversicolor)。独木舟侵蚀菌为宛氏拟青霉(Paecilomyces varioti)。表1不同样本丝状真菌鉴定结果
权利要求
1.一种对潮湿遗址环境丝状真菌的生长抑制方法，包括以下步骤: 步骤一，采样，将被测环境目标样本进行无菌采样； 步骤二，孢子悬液的制备，将供试菌株接种在PDA培养基斜面上，置于28°C恒温培养箱内培养5d-7d后，用无菌生理盐水将成熟的孢子洗下，孢子原液用无菌脱脂棉进行过滤，在孢子滤液中加入无菌玻璃珠后置摇床振荡5分钟，用血球计数板计算孢子数量并调节孢子浓度在102-103个/ml，备用； 步骤三,将葡聚糖酶2g溶于5ml pH=6的0.lmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液,用0.45 μ m的超滤膜过滤除菌，将15ml培养基倾入平皿，冷却制成平板后，吸取几丁质酶液200u酶液涂布于培养基上，随之加入1000iT2000u的葡聚糖酶涂布于培养基上，静置片刻后将供试菌种的孢子悬液0.1ml涂布于培养基上，28°C，培养3d 5d，观察生长情况并计数。
2.根据权利要 求1所述的对潮湿遗址环境丝状真菌的生长抑制方法，其特征在于所述被测环境目标样本包括空气、土壤、独木舟和墙体； 空气采样采用仪器法即撞击式空气微生物采样器，采样高度距离地面1.0 m 1.2m,采集的培养基平板运送到实验室后直接放入28°C培养箱中培养48h-96h后分离、鉴定；土壤采样用无菌金属小勺采集表层土壤3g 5g装入无菌玻璃试管中； 独木舟采样用无菌金属小勺刮取少许独木舟软腐木，装入无菌玻璃试管中； 采集的土壤样本和软腐木样本运送到实验室后在无菌条件下分别称取Ig放入装有99ml灭菌生理盐水并带玻璃珠的三角烧瓶中，振荡30分钟，静置后，取Iml并注入9ml灭菌生理盐水，振摇试管，混合均匀，并做10倍递增稀释，分别取不同稀释度的样品液0.1ml于培养基平板，用无菌玻璃三角刮棒涂布于培养基表面； 字幕墙采样:用10 X IOcm2灭菌板置于字幕墙处，用浸有无菌生理盐水采样液的棉拭子I支，在灭菌板内横竖来回涂抹，并随之转动棉拭子，剪去手接触部分，将棉拭子放入装有IOml采样液的试管中待运送到实验室后在无菌条件下取ImL并注入9ml灭菌生理盐水，振摇试管，混合均匀，并做10倍递增稀释，分别取不同稀释度的样品液0.1ml于培养基平板，用无菌玻璃三角刮棒涂布于培养基表面。
3.根据权利要求1所述的对潮湿遗址环境丝状真菌的生长抑制方法，其特征在于所述被测环境目标样本为字幕墙时，可采用200u几丁质酶加上2000u葡聚糖酶涂抹去除丝状真菌。
4.根据权利要求1所述的对潮湿遗址环境丝状真菌的生长抑制方法，其特征在于所述被测环境目标样本为独木舟时，用200u几丁质酶加上IOOOu葡聚糖酶涂抹去除丝状真菌。
全文摘要
本发明涉及一种丝状真菌的生长抑制方法，尤其是一种潮湿环境下丝状真菌的生长抑制方法。包括以下步骤步骤一，采样，将被测环境目标样本进行无菌采样；步骤二，孢子悬液的制备；步骤三，将葡聚糖酶2g溶于5mlpH=6的0.1mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液，用0.45μm的超滤膜过滤除菌，将15ml培养基倾入平皿，冷却制成平板后，吸取几丁质酶液200u酶液涂布于培养基上，随之加入1000u~2000u的葡聚糖酶涂布于培养基上，静置片刻后将供试菌种的孢子悬液0.1ml涂布于培养基上，28℃，培养3d～5d，观察生长情况并计数。本发明是一种适应于潮湿遗址环境应用的丝状真菌生长抑制方法，利用几丁质酶和葡聚糖酶的复合协同作用，更能有效地抑制丝状真菌的生长发育，同时不会对环境造成二次污染和破坏。
文档编号C12Q1/18GK103103247SQ20131001141
公开日2013年5月15日 申请日期2013年1月11日 优先权日2013年1月11日
发明者吴健, 李东风, 楼卫 申请人:杭州市萧山跨湖桥遗址博物馆