一种高吸附镉的丝状真菌产黄青霉j-5及制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高吸附镉的丝状真菌产黄青霉J-5及制备方法和应用，步骤是：首先称取10g镉污染土壤于90mL的灭菌生理盐水中，于恒温摇床上振荡，静置后，取上清液进行稀释；其次是将不同稀释倍数的稀释液涂布在含有10mM镉的马丁孟加拉红平板上，倒置于恒温培养箱中培养；第三是将平板上生长的微生物进行划线分离纯化，然后重新涂布到上述含镉的马丁孟加拉红平板上进行培养；第四是经分离筛选后，保存对镉具有稳定抗性能力的菌株，在PDA斜面上进行保存。获得的丝状真菌产黄青霉J-5对多种重金属具有高耐受性和高吸附特性，原料易获取，成本低廉。该菌株对环境中的重金属具有较高的固定能力，能降低其生物毒害性，适用于大面积污染土壤的原位修复。
【专利说明】一种高吸附镉的丝状真菌产黄青霉J-5及制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于环境治理领域。更具体涉及一种对多种重金属具有高耐受性和高吸附能力的丝状真菌的制备方法，同时还涉及一种丝状真菌产黄青霉J-5的用途。
【背景技术】
[0002]镉(Cd)在自然界中主要以硫镉矿等13种矿物的形式存在，且常伴生于其他金属矿，如铅锌矿等。Cd在地壳中的平均浓度为0.15mg/Kg (颜明娟，1999)，土壤Cd浓度在
0.01_2mg/Kg,各类水体中Cd浓度为0.11-10 μ g/Kg。虽然正常情况下,Cd在自然环境中以痕量的状态存在，但是人类的活动使其在环境中的含量以及分布范围日益扩大。如Cd可以直接进入大气、水体和土壤，并在不同环境中迁移，造成环境污染；尤其是工业废水废渣废气的排放，更是造成了严重的环境污染。
[0003]土壤环境中，Cd以多种形态存在。依据Sposito连续提取法(1982)，土壤中的镉的形态可分为交换态、水溶态、有机结合态、碳酸盐结合态、硫化物残渣态和残渣态。Cd在土壤中各种形态所占比例的不 同，直接影响其在土壤中的迁移、转化、吸附、解吸能力，以及对生物的生理毒性。按照Cd对生物可利用性由高到低分别为:水溶态和交换态〉碳酸盐结合态 > 有机结合态 > 残渣态。水溶态和交换态Cd对生物毒性最强。土壤中Cd的存在形态受到其本身的性质、含量、土壤组成结构(如:有机质、碳酸盐、矿物和微生物)和环境条件(如:PH，温度和湿度等)的影响。因此，随着环境的变化，Cd的各种形态之间是可以发生转化的，且这种转化行为在一定的体系中与一般的化学平衡原理相似，如酸碱平衡、氧化还原、吸附解吸、配位平衡以及沉淀溶解之间的平衡。不过，因为土壤本身是一个复杂的体系，这种转化行为可能会更加复杂(廖敏等，1999)。
[0004]在水环境中，Cd的主要以离子态镉存在。此外，Cd可与水体中的多种配体形成可溶物，如Cd (or) +，HCd02_，CdCl+, Cd (NH3)2+，Cd (HCO3) 2等。Cd在水体中的迁移能力可认为是:离子态〉络合态〉难溶态。姚重华等(1982)研究表明水环境发生重金属污染时，Cd总量的增加对自身分布除对吸附态有所改变外基本不会对原来的形态分布造成影响。水体中的悬浮物，沉积物，水生生物等因素均会影响水体中不同形态Cd之间的转化。环境中Cd的不同形态之间的转化行为为环境中Cd污染的治理提供了一定的理论支持，如何有效降低环境中Cd的生物有效性，减少Cd在农产品中的富集，是近些年来国内外环保领域的研究热点(Reddy and Parupudi, 1997;Basta et al., 2001;Diels etal., 2002;ffei andZhou, 2006)。
[0005]传统治理重金属污水的方法确实收到了一定的效果，但是面对污染日益严重的现状，从长远来看这些方法不同程度的存在成本高、能耗高、操作繁琐，容易引发二次污染等缺点。自从1949年Ruchhoft提出了生物吸附法(活性污泥)去除污水中的重金属钚( 239Pu)以来，生物法修复重金属污水受到越来越多的关注，特别是利用微生物处理重金属污水的研究逐渐成为研究热点(Kratochvil and Volesky, 1998; Volesky, 1999)。
[0006]在生物吸附治理重金属污染过程中，丝状真菌受到了广泛的关注。真菌的细胞表面结构类似于离子型交换树脂，具有潜在的吸附，离子交换以及共价结合重金属离子的能力(Gadd, 1993; KrantzRiilcker et al., 1993; Kapoor et al.，1999)。真菌对于重金属离子的吸附机制从能量代谢角度可以分为两种不同的类型:一种是迅速作用的非能量依赖性，主要是通过菌体表面的一些结构如羧基，羟基，巯基及磷酸基团等进行的物理化学吸附(Gadd, 1993)，另一种则是缓慢的生理代谢依赖型，如跨膜转运及细胞内沉淀(Vodnik etal., 1998) 0因此，活的菌体和死亡的菌丝体都可以用作处理重金属的生物吸附剂。一些研究甚至表明死亡的菌丝体对于重金属的吸附量要大于活的菌体。Jarosz-WilkoLazka等(2002)研究了白腐真菌Trametesversicolor对重金属Cd的吸附能力，发现白腐真菌对于液相环境的Cd具有很强的吸附能力；经过两个小时的处理，可以去除大部分的Cd。其中快速的能量非依赖型的吸附量可以达到-2mg/(g干菌体)，而慢速的能量依赖型的吸附量为-0.3mg/(g干菌体)。Malik (2004)认为利用活细胞来进行重金属的生物吸附将更符合实际，且能表现出更好的效果。
[0007]真菌对重金属的耐受性或抗性有着多种不同的生物学机制，如胞外分泌物对重金属的沉淀作用、络合作用、结晶化作用、金属价态的转变、细胞壁组分及色素分子对重金属离子的吸附、壁膜渗透性的改变、主动外排机制以及细胞内的富集隔离等(Gadd, 1993;Mehra andWinge, 1991)。Zafar等(2007)从重金属污染的农田土壤中筛选到两株具有重金属抗性的丝状真菌，鉴定为Aspergillus和Rhizopus。这两株丝状真菌对CM及Cr具有高生物吸附能力，显示出潜在的重金属生物吸附剂的运用前景。而更早的Wasay等(1998)利用Aspergillus niger可以产生有机酸的特性来处理三种不同质地的重金属污染的土壤(粘壤土，粘土，沙土)，发现经过20到25天的处理，可以使这三种土壤中的重金属符合魁北克所制定的土壤重金属标准。总体而言，目前利用真菌处理重金属污染土壤的报道不多，真菌资源相当有限，成熟的处理工艺和方法还有待进一步的研发和完善。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是在于提供了一种高效吸附重金属的丝状真菌产黄青霉J-5。本发明从镉污染土壤中分离了一株丝状真菌`。该菌株在实验室条件下能显著吸附重金属镉；同时，该丝状真菌与小白菜共生水培显示该丝状真菌可以高效吸附固定培养液中的镉，降低其生物有效性，提高植物的产量并降低植物对镉的吸收，显示了本发明所提供的丝状真菌在重金属污染土壤及水体治理过程中的广阔运用前景。
[0009]本发明的另一个目的是在于提供了一种高效吸附重金属的丝状真菌产黄青霉J-5的制备方法，该制备方法简便快捷，所获取的菌体具有高吸附重金属的能力，且吸附过程不受营养条件的限制。
[0010]本发明的再一个目的在于提供了一种丝状真菌产黄青霉J-5在重金属污染水体及土壤的生物修复中的应用。丝状真菌产黄青霉J-5可以有效吸附固定重金属，降低其生物有效性，达到治理重金属污染的目的，且其具有成本低廉、不易引起二次污染的特点，具备商业化发展的潜力。
[0011]本发明是这样实现的:
[0012]一种高效吸附重金属的丝状真菌产黄青霉J-5的制备方法，其步骤为分离、纯化和复筛。具体过程为:首先称取IOg镉污染土壤于90mL的灭菌生理盐水中，于28°C恒温摇床上150r/min振荡15min，静置Imin后，取上清液进行10倍系列稀释；其次是将100 μ L不同稀释倍数的稀释液涂布在含有IOmM镉的马丁孟加拉红平板上，倒置于28°C恒温培养箱中培养5d ;第三是将平板上生长的微生物进行划线分离纯化，然后重新涂布到上述含镉的马丁孟加拉红平板上进行培养；第四是经10次分离筛选后，保存对镉具有稳定抗性能力的菌株，在PDA斜面上进行保存，备用。
[0013] 申请人:将上述分离得到的菌株中的一株菌命名为丝状真菌J-5，并鉴定为产黄青霉(Penicillium chrysogenum) J-5, 申请人:于2012年4月24日将该菌株送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏地址:中国武汉武汉大学，保藏编号为=CCTCC NO:M2012137,分类命名:产黄青霉 J_5Penicillium chrysogenum J-5。
[0014]丝状真菌产黄青霉J-5的特性如下:
[0015]①生物学特性:丝状真菌，帚状分支结构明显，专性需氧，最适生长温度200C-28°C ;在PDA培养基中产孢量大，孢子形成初期为淡绿色，后期为墨绿色，培养中后期有明显黄色色素产生。
[0016]②遗传学特性:结合形态学观察和分子生物鉴定确认该菌为产黄青霉。
[0017]③培养条件:保存该真菌及获取其孢子时所使用的培养基为PDA培养基；用于吸附实验及测试其对重金属耐受性用矿物盐培养基(丽):(NH4) 2S045g/L; KH2PO415g/L; MgSO40.6g/L; CaCl20.6g/L; FeSO4.7Η20 5mg/L; CoCl22mg/L;葡萄糖 20g/L，pH 5.0.121。。高压蒸汽灭菌30min。培养该菌可以孢子的形式进行接种:以2%体积比的吐温-80冲洗PDA斜面上的孢子，然后用0.2%体积比的吐温-80稀释至需要的孢子浓度后接种，并进行28°C，150r/min摇瓶培养。图1为J-5在矿物盐(MM)培养基中的生长曲线，培养5d后进入平台期。
[0018]③功能特性:具有对多种重金属的耐受性。按1%接种量接种丝状真菌J-5孢子悬液到含特定重金属浓度的矿物 盐培养基中进行培养，7d后观察其生长状况。丝状真菌J-5对不同重金属离子的耐受性检测结果为:液体培养条件下对镉(Cd2+)320mM、铜(Cu2+)80mM、钴(Co2+) 30mM、铬(Cr6+) 5mM、铬(Cr3+) 35mM、锌(Zn2+) 70mM等重金属有较好的耐受性。
[0019]一种丝状真菌产黄青霉J-5在重金属污染水体及土壤的生物修复中的应用，其步骤是:
[0020](I)静态镉吸附:
[0021]将菌株丝状真菌J-5在PDA培养基上培养5d后，收集孢子，制备孢子悬液；然后按照1:100的比例接种到200mL的新鲜矿物盐培养基中培养5d，过滤收集菌体并进行真空冷冻干燥；然后，将干菌粉过300 μ m孔径的筛子后，用于吸附镉的分析。
[0022]将0.0lg的经过上述预处理的菌粉，加入到含有20mL镉溶液的50mL离心管中，然后将离心管置于28°C恒温摇床中，150r/min维持240min。吸附过程中分别在0，15，30，45，60，120,180和240min取100 μ L上清液，稀释后进行镉含量分析。
[0023](2)电镀废水中重金属移除实验:
[0024]发明人测试了丝状真菌J-5对实际电镀废水中重金属移除能力。采用实施例2.1相同的处理方法，制备干菌粉。将0.0lg的干菌粉加入到20ml的电镀废水(Cd2+:0.13mg/L; Cu2+:0.15mg/L)中，28°C，150r/min处理2h后过滤收集上清液，按照前述方法测定吸附前后水体中镉的浓度。[0025](3)丝状真菌产黄青霉J-5与植物共生水培实验:
[0026]本实施例旨在证明本发明所提供的丝状真菌J-5在模拟重金属污染土壤中对植物生长的保护能力。小白菜的种植和培养方法参见文献(Green, 1989;于方明等，2008);丝状真菌J-5干菌粉的处理方法如前文实施例2所述。在接种丝状真菌J-5至水培体系前，收集丝状真菌J-5孢子并调节孢子悬液至IO7个/mL，备用。
[0027]以小白菜(Brassica chinensis L.)为供试植物，催芽后取10颗发芽状况一致的种子于装有IOOg灭菌蛭石的定植杯中。出苗后每2d烧IOmL灭菌自来水，5d后换0.5倍浓度的Hoagland’ s营养液(于方明等，2008)，待小白菜长出2片真叶后开始浇全营养液。培养IOd后间苗至4株，然后按照不同处理方式分别加入IOOyL J-5孢子悬液(终浓度为IO4个/g蛭石)和0.0lg的冻干J-5菌体。2d后，向培样体系中分别加入IOmL镉含量不同的Hoagland’ s营养液，使其加入到培养体系中镉的终浓度分别为0，0.1, 0.5，I和2mg/Kg蛭石。后续培养过程中不再加入含有镉的营养液，但每2d补充营养液，保证水含量基本恒定。继续培养30d后收获植株；将收获的植株的叶片部分，65°C烘干48h至恒重后，取0.0lg于ImL浓硝酸中进行消化处理，稀释过滤后测定镉含量。上述盆栽试验每种处理设置4次重复，整个试验在光照培 养箱中完成，光照14h，温度28°C，相对湿度60%。
[0028]因此，本发明可总结为: 申请人:从镉污染土壤中，利用真菌培养方法，进行真菌筛选；得到一株能在含IOmM镉的马丁孟加拉红培养基上生长的丝状真菌， 申请人:将其命名为J-5。该丝状真菌为产黄青霉，该菌株的保存及产孢子培养基为PDA培养基。
[0029] 申请人:利用丝状真菌J-5进行静态镉吸附和电镀废水中重金属移除实验，显示该菌株能够快速高效吸附重金属镉。随后进行的J-5与植物的共生水培实验显示该菌株能够降低植物对镉的吸收，增加小白菜的产量。
[0030]本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果:
[0031](I)菌体原料易获取，成本低廉。
[0032](2)利用丝状真菌产黄青霉J-5的冻干菌体作为生物吸附剂不仅可以高效吸附移除污水中的重金属离子，同时还具备良好的吸附剂再生能力，拥有商业化应用的潜能。
[0033](3)丝状真菌产黄青霉J-5对多种重金属具有高耐受性和高吸附特性，对环境中的重金属具有较高的固定能力，能明显降低其生物毒害性。该菌株可以在高浓度重金属水平下存活，因此以产黄青霉J-5作为土壤重金属钝化剂可实现对土壤中重金属长期固定化的同时，避免向环境中多次施加重金属的钝化剂，具备原位修复大面积污染土壤的潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1为一种丝状真菌J-5在矿物盐培养基中生长曲线测定结果。
[0035]图2为一种丝状真菌J-5的静态镉吸附量测定结果。
[0036]图3为一种丝状真菌J-5对实际电镀污水处理结果。
[0037]图4为一种丝状真菌J-5以不同方式与植物共生水培对植物产量的影响。
[0038]图中:CK指示实验条件为不添加任何形式的J-5 ;DJ指示添加死亡冻干J-5 ;LJ指示添加
[0039]J-5 孢子。
[0040]图5为一种丝状真菌J-5以不同方式与植物共生水培对植物叶片镉含量的影响。[0041]图中:CK指示实验条件为不添加任何形式的J-5 ;DJ指示添加死亡冻干J-5 ;LJ指示添加
[0042]J-5 孢子。
【具体实施方式】
[0043]以下叙述是根据本发明实施方案的实施例。应该说明的是，本发明的实施例对于本发明只有说明作用，而没有限制作用。本发明中所涉及的其他各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。
[0044]实施例1:丝状真菌J-5的分离及重金属耐受能力测试
[0045]1、菌株分离:
[0046]称取IOg镉污染土壤于90mL的灭菌生理盐水中，于28°C恒温摇床上150r/min振荡15min，静置Imin后，取上清液进行10倍系列稀释；然后将100 μ L不同稀释倍数的稀释液涂布在含有IOmM镉的马丁孟加拉红平板上，倒置于28°C恒温培养箱中培养5d。将平板上生长的微生物进行划线分离纯化，然后重新涂布到上述含镉的马丁孟加拉红平板上进行培养。经10次分离筛选后，保存对镉具有稳定抗性能力的菌株，在PDA斜面上进行保存，备用。
[0047] 申请人:将上述分离得到的菌株中的一株菌命名为丝状真菌J-5，产黄青霉菌(Penicilliumchrysogenum), 申请人:于2012年4月24日将该菌株送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为:CCTCC NO:M2012137。
[0048]2、菌株的生物学:
[0049]①生物学特性:丝状真菌，帚状分支结构明显，专性需氧，最适生长温度200C-28°C ;在PDA培养基中产孢量大，孢子形成初期为淡绿色，后期为墨绿色，培养中后期有明显黄色色素产生。
[0050]②遗传学特性:结合形态学观察和分子生物鉴定确认该菌为产黄青霉。
[0051]③培养条件:保存该真菌及获取其孢子时所使用的培养基为PDA培养基；用于吸附实验及测试其对重金属耐受性用矿物盐培养基(丽):(NH4) 2S045g/L; KH2PO415g/L; MgSO40.6g/L; CaCl20.6g/L; FeSO4.7Η20 5mg/L; CoCl22mg/L;葡萄糖 20g/L，pH 5.0.121。。高压蒸汽灭菌30min。培养该菌可以孢子的形式进行接种:以2%体积比的吐温-80冲洗PDA斜面上的孢子，然后用0.2%体积比的吐温-80稀释至需要的孢子浓度后接种，并进行28°C，150r/min摇瓶培养。图1为J-5在矿物盐(MM)培养基中的生长曲线，培养5d后进入平台期。
[0052]3、J-5的重金属耐受性测试:
[0053]按1%接种量接种丝状真菌J-5孢子悬液到含特定重金属浓度的矿物盐培养基中进行培养，7d后观察其生长状况。丝状真菌J-5对不同重金属离子的耐受性检测结果为:液体培养条件下对镉(Cd2+) 320mM、铜(Cu2+) 80mM、钴(Co2+) 30mM、铬(Cr6+) 5mM、铬(Cr3+) 35mM、锌(Zn2+) 70mM等重金属有较好的耐受性。
[0054]实施例2:丝状真菌产黄青霉J-5镉吸附能力实验
[0055]2.1静态镉吸附:[0056]将菌株丝状真菌J-5在PDA培养基上培养5d后，收集孢子，制备孢子悬液；然后按照1:100的比例接种到200mL的新鲜矿物盐培养基中培养5d，过滤收集菌体并进行真空冷冻干燥；然后，将干菌粉过300 μ m孔径的筛子后，用于吸附镉的分析。
[0057]将0.0lg的经过上述预处理的菌粉，加入到含有20mL镉溶液的50mL离心管中，然后将离心管置于28°C恒温摇床中，150r/min维持240min。吸附过程中分别在0，15，30，45，60，120,180和240min取100 μ L上清液，稀释后进行镉含量分析。吸附实验设置3次重复。镉含量的分析采用石墨炉原子吸收分光光度计进行测定(孙西宁等，2007)。如图2所示，随着吸附时间的增加，菌体对镉的单位吸附量逐渐增大。在最初的45min内吸附量达至最大吸附量的75%以上，随后逐渐进入吸附平衡。其中，丝状真菌J-5干粉在500mg/L镉溶液中对镉的吸附量达到87.31 ±2.04mg/g (干重)。
[0058]2.2电镀废水中重金属移除实验:
[0059]随后发明人测试了丝状真菌J-5对实际电镀废水中重金属移除能力。采用实施例2.1相同的处理方法，制备干菌粉。将0.0lg的干菌粉加入到20ml的电镀废水(Cd2+: 0.13mg/L;Cu2+:0.15mg/L)中，28°C，150r/min 处理 2h 后过滤收集上清液，按照前述方法测定吸附前后水体中镉的浓度。从图3可以看出，丝状真菌J-5对镉的移除能力为85.8±2.06%，对铜的移除能力为61.7±1.51%。实验结果表明本发明中的丝状真菌J-5能高效的吸附移除实际电镀废水中的重金属镉，同时对铜也有较高的移除能力。
[0060]实施例3:丝状真菌J-5与植物共生水培实验
[0061]本实施例旨在 证明本发明所提供的丝状真菌J-5在模拟重金属污染土壤中对植物生长的保护能力。小白菜的种植和培养方法参见文献(Green, 1989;于方明等，2008);丝状真菌J-5干菌粉的处理方法如前文实施例2所述。在接种丝状真菌J-5至水培体系前，收集丝状真菌J-5孢子并调节孢子悬液至IO7个/mL，备用。
[0062]以小白菜(Brassica chinensis L.)为供试植物，催芽后取10颗发芽状况一致的种子于装有IOOg灭菌蛭石的定植杯中。出苗后每2d烧IOmL灭菌自来水，5d后换0.5倍浓度的Hoagland’ s营养液(于方明等，2008)，待小白菜长出2片真叶后开始浇全营养液。培养IOd后间苗至4株，然后按照不同处理方式分别加入IOOyL J-5孢子悬液(终浓度为IO4个/g蛭石)和0.0lg的冻干J-5菌体。2d后，向培样体系中分别加入IOmL镉含量不同的Hoagland’ s营养液，使其加入到培养体系中镉的终浓度分别为0，0.1, 0.5，I和2mg/Kg蛭石。后续培养过程中不再加入含有镉的营养液，但每2d补充营养液，保证水含量基本恒定。继续培养30d后收获植株；将收获的植株的叶片部分，65°C烘干48h至恒重后，取0.0lg于ImL浓硝酸中进行消化处理，稀释过滤后测定镉含量。上述盆栽试验每种处理设置4次重复，整个试验在光照培养箱中完成，光照14h，温度28°C，相对湿度60%。
[0063]实验结果表明，加入镉的植株都表现出生长迟缓和植株矮小的现象。由图4可知，在镉浓度为lmg/Kg蛭石和2mg/Kg蛭石时，与CK处理相比，经J-5冻干菌体和J-5孢子处理的小白菜产量显著提高(P〈0.05)。由图5可以看出，在不同镉污染程度下，接种J-5孢子使小白菜对镉的吸收降低了 1.2%-63.6%。这表明活性丝状真菌J-5有效降低了镉的生物有效性及其对植物的毒性，进而使小白菜产量提高。
[0064]上述实施案例的结果说明本发明中分离获取的丝状真菌J-5对镉有较高的吸附能力，达到了降低镉的生物有效性的目的。
【权利要求】
1.一种丝状真菌产黄青霉,其特征在于:产黄青霉菌chrysogenum)J-5, CCTCC, CCTCC NO:M2012137。
2.权利要求1所涉的一种丝状真菌产黄青霉J-5在重金属污染水体的生物修复中的应用。
3.权利要求1所涉的一种丝状真菌产黄青霉J-5在重金属污染土壤的生物修复中的应用 。
【文档编号】B01J20/28GK103451105SQ201210181161
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年6月4日 优先权日:2012年6月4日
【发明者】黄巧云, 陈雯莉, 徐兴健, 夏璐, 朱伟, 张哲轶 申请人:华中农业大学