专利名称：利用木糖发酵产生乙醇的丝状真菌及其制备方法
技术领域：
本发明的属于环境生物技术应用领域，具体涉及一种真菌及其制备方法。
(二)
背景技术：
世界能源危机的出现以及人们环保意识的增强，生物质能源已受到极大关注。 燃料乙醇由于它的污染小，具有环境友好性的特点，成为新型燃料资源有望取代日益减 少的化石能源(如石油和煤炭)。传统乙醇发酵原料为玉米等粮食作物，粮食短缺的今天 这一生产方式受到极大的限制。木质纤维素物质(如农作物废弃物、木屑、薯渣等)是世 界上最为丰富的生物质资源，由纤维素、半纤维素和木质素组成，其水解产物主要是是 葡萄糖和木糖。酿酒酵母能发酵葡萄糖但不能发酵木糖产生乙醇。80年代以来，众多的 学者进行了木糖菌种的筛选以及菌种遗传工程改造研究，木糖发酵微生物主要集中在毕 氏酵母(Pichia)，假丝酵母(Candida)和管囊酵母(Pachysolen)三个属，构建基因重组菌常 用的宿主菌种有酿酒酵母(S.cerevisiae)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)和大肠杆菌 (E.coli)，对丝状真菌的木糖发酵研究的很少。
(三)
发明内容
本发明的目的在于提供一种原料成本低，而且培养方式为静止培养(半好氧状 态)省去了搅拌工序，减少了工艺成本，从而降低了生产成本的利用木糖发酵产生乙醇的 丝状真菌及其制备方法。 本发明的微生物尖孢镰刀菌Fusarium xysporam CS-28是于2009年03月16 日保藏于"中国典型培养物保藏中心"，保藏登记号为CCTCC: M209040，命名 为尖孢镰刀菌CS-28(Fusarium xysporum CS-28)的菌株，属于真菌界(Fungi)，子囊菌 门(Ascimycota)， 盘菌亚门(Pezizomycotina)， 粪壳菌纟冈(Sordariomycetes)， 肉座菌目 (Hypocreales)，有丝分裂真菌肉座菌禾斗(Mitosporic Hypocreales)，镰刀菌属(Fusarium)。
针对目前能够利用木糖发酵菌种少，乙醇产率不高的现状，本发明从自然界中 筛选到一株丝状真菌发酵木糖产乙醇的菌株，对其进行了形态学和分子生物学鉴定，同 时对其发酵条件进行了优化，是一株利用木糖发酵产生乙醇丝状真菌。其形态学特性
为 结合图1、图2，该菌株在PDA培养基上培养2d后菌落直径超过2.5cm， 7d达 8-9cm;在室温(25tO下，菌丝生长良好，棉絮状至绒毛状，最初白色，逐渐中央粉色， 后期转变为紫色，培养基反面深紫色；结合图3、图4，菌丝染色后显微镜观察结果，菌 丝有隔、分枝、透明；分生孢子纺锤-镰刀形，两端渐变窄，基部无脚孢，有隔，有大小 两种类型分生孢子，小型分生孢子数量较多，从菌丝的侧生而单出的瓶状小梗上长出或 从分生孢子梗上长出，不呈链生而是假头状着生；椭圆形，纺锤形，卵形，逗点形；大 型分生孢子时常较少，产于粘孢团中或从分孢子梗上长出；镰刀形，纺锤形；顶端细胞 窄细。
经分子生物学鉴定尖孢镰刀菌Fusarium xysporum CS-28的18s rDNA转录间区 (Internaltranscribedspacer， ITS)的序列结果 1 TGATATGCTT AAGTTCAGCG GGTATTCCTA CCTGATCCGA GGTCAACATT CAGAAGTTGG 61 GGGTTTAACG GCTTGGCCGC GCCGCGTTCC AGTTGCGAGG GTTTTACTAC TACGCAATGG 121 AGGCTGCAGC GAGACCGCCA CTAGATTTCG GGGCCGGCTT GCCGCAAGGG CTCGCCGATC 181 CCCAACACCA AACCCGAGGG CTTGAGGGTT GAAATGACGC TCGAACAGGC ATGCCCGCCA 241 GAATACTGGC GGGCGCAATG TGCGTTCAAA GATTCGATGA TTCACTGAAT TCTGCAATTC 301 ACATTACTTA TCGCATTTTG CTGCGTTCTT CATCGATGCC AGAACCAAGA GATCCGTTGT 361 TGAAAGTTTT GATTTATTTA TGGTTTTACT CAGAAGTTAC ATATAGAAAC AGAGTTTAGG 421 GGTCCTCTGG CGGGCCGTCC CGTTTTACCG GGAGCGGGCT GATCCGCCGA GGCAACAAGT 481 GGTATGTTCA CAGGGGTTTG GGAGTTGTAA ACTCGGTAAT GATCCCTCCG CAGGT 生长特性菌体对培养基的要求不高，在PDA培养基上pH自然即可生长，培
养温度在20-30°C。 代谢特征 l)不同碳源的利用情况 菌株能以木糖、果糖、葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、玉米秸秆、淀粉、羧 甲基纤维素钠、木糖醇、甘露醇作为碳源进行发酵产生乙醇。菌种对蔗糖、葡萄糖、淀 粉、半乳糖的酒精发酵能力最强，对乳糖的发酵能力最弱。镰刀菌对12种碳源均有不同 程度的酒精发酵能力，其碳源应用谱广泛，有望成为工业发酵待选菌种。
2)菌体对氮源利用情况 分别选用酵母提取物，蛋白胨，豆面，玉米粉，豆饼水，豆粕，尿， (NH4)2S04， KN03， NH4N03， NaN03， NH4AC作为氮源，以木糖作为碳源进行发酵试
验，结果见图6:不同氮源对尖孢镰刀菌发酵产乙醇的试验结果显示有机氮源比无机
氮源产乙醇的量高。在有机氮源中黄豆面的产乙醇量为4.28ml/L，与yeast extract(酵母 提取物)(4.25ml/l)的发酵效果持平，考虑到发酵成本，以下的发酵试验中采用黄豆面作为 氮源。在无机氮源中，硝态氮比铵态氮效果好，其中NaN03的发酵效率最高，达到了 2.61ml/L。 从图6中还可以看出木糖发酵时间在第6天时乙醇含量最好，到第7天时开始 下降。 发酵特性结合图7，
1)初始pH值对发酵的影响初始pH值对发酵的影响很大，初始pH值分别设 为5.4， 5.6， 5.8， 6.0， 6.2，随着pH值得升高乙醇产量呈上升趋势，pH 6.0时乙醇产量 最高为5.51ml/l，随后又急剧下降。 2)结合图8，温度对发酵的影响温度对乙醇发酵的影响极大，温度过高会增加 乙醇的蒸发，温度过低影响菌体生长，从而影响乙醇产量，试验结果表明温度为3(TC 乙醇产量最高。各种培养基 斜面保存培养基每升培养液含木糖20g，琼脂20g，酵母提取物10g，蛋白胨 5g， pH自然； 活化液体培养基每升培养液含木糖10g，马铃薯200g， pH值自然； 活化固体培养基每升培养液含木糖10g，马铃薯200g，琼脂20g， pH值自
然；种子培养基每L培养液含木糖10g， CaCl20.1g， MgSO40.2g， KH2P04 2g，氮
源依试验而定 发酵培养基每L培养液含CaCl2 O.lg， MgSO4 0.2g， KH2P04 2g，碳源和氮源
依试验而定。
方法 培养方法从斜面培养基中挑起少量菌丝与活化固体培养基中，3(TC培养7 天，用无菌水洗下孢子，按1 X 106个孢子每升接种于装有20ml种子培养液的100ml摇瓶 中，30°C 200rpm培养2天。 发酵方法10X的接种量接种于装有50ml发酵培养基的100ml摇瓶在中，静止 培养数天，进行乙醇含量的测定。
本发明的优点和效果有 本发明的丝状真菌能直接利用木糖发酵产生乙醇，属于环境生物技术应用领 域，特别对纤维素水解后的可发酵糖类的充分利用提高良好途径。本发明的丝状真菌尖 孢镰刀菌以木糖为原料进行发酵产生乙醇，最好的氮源是酵母提取物，但本发明的最好 氮源选择与其乙醇产量相当的黄豆面，大大降低了原料成本，而且培养方式为静止培养 (半好氧状态)省去了搅拌工序，减少了工艺成本，从而降低了生产成本。
同时本发明的菌种具有产生纤维素酶，半纤维素酶，淀粉酶等多种酶系的特 点，能利用玉米秸秆，淀粉以及羧甲基纤维素钠为碳源进行发酵，能够实现同时糖化和 发酵过程。它不仅能发酵纤维素等聚合物，还能同时多种单糖(如葡萄糖，半乳糖等)， 只利用单一菌种即可实现降解纤维素发酵生产乙醇的目的。通过进一步的产酶条件优化 可提高对秸秆的利用率，为早日实现利用纤维素木质原料进行能源转化提高新的菌种。
图1-图2为尖孢镰刀菌在PDA培养基中生长7天的菌落形态示意图；
图3-图4为孢子形态的显微观察示意图；
图5为不同碳源对尖孢镰刀菌发酵影响示意图；
图6为不同氮源对尖孢镰刀菌发酵的影响示意图；
图7为初始pH值对发酵的影响示意5
图8为温度对发酵的影响示意图。 具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明
实施例1 :本实施例采用种子培养基每L培养液含木糖10g，黄豆面10g， NaN03 2g， CaCl2 O.lg， MgS04 0.2g， KH2P04 2g， pH值6.0 ;发酵培养基每L培养液含木糖20g，黄豆面10g， NaN03 2g， CaCl2 O.lg， MgS04 0.2g， KH2P04 2g， pH值6.0 ; 培养方法从斜面培养基中挑起少量菌丝与活化固体培养基中，3(TC培养7 天，用无菌水洗下孢子，按1 X 106个孢子每升接种于装有20ml种子培养液的100ml摇瓶 中，30°C 200rpm培养2天。 发酵方法10%的接种量接种于装有50ml发酵培养基的100ml摇瓶在中，静止 培养6天，进行乙醇含量的测定。 应用上述的培养基和方法进行木糖发酵试验，在2%的木糖发酵培养基中，乙醇
的最大浓度为5.89g/L，产量为0.295g/g，达到理论产量(0.51g/g)的57.84%。 实施例2 : 土样采自哈尔滨平房区堆积两年的玉米秸秆，E.coli T叩IO为发明人
实验室保存。
试剂TaqDNA聚合酶、pMD-18T载体试剂盒为宝生物工程(大连)有限公司产品；胶 回收试剂盒为上海华舜生物公司，引物合成和测序由上海生工生物技术有限公司完成； 木糖购自美国Sigma公司；其它试剂均为国产分析纯试剂。
培养基初筛培养基(PXA):马铃薯200g/L，木糖20g/L，琼脂20g/L， pH值6.0。
复筛培养基木糖1%，酵母粉0.4%，蛋白胨0.2%， (NH4)2SO40.6%， KH2P04 0.1%， MgS04 7H2O0.1%， CaCl20.5%。
方法菌种分离筛选 取lg采集的土样溶于10mL无菌水中3(TC振荡lh，经适当稀释后，涂布于PXA 平板上，3(TC恒温培养48h;挑取生长较快菌落，经多次分离纯化，获得的丝状真菌纯 培养物保存。 纯化后的单菌落经复筛选培养基进行杜氏管发酵试验进一步筛选，最后利用发 酵培养基进行乙醇含量的测定，挑选出乙醇含量最高的菌株作为下一步研究对象。
形态学鉴定参考《真菌鉴定手册》。 18SrDNA弓|物Tl : 5' -TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'
14:5' -TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3' PCR反应体系所有PCR反应均在20iiL标准反应体系中进行，其中含2yL Buffer缓冲液，1.6ii 2.5mMdNTPs，每一引物均为luL(10mM)， 0.125uLTaq酶，1 P L模 板DNA，加无菌超纯水至20iiL，于PCR仪上按94t:预变性5min，然后按94"C、 30s， 56°C、 30s， 72°C、 lmin，循环32次，最后72。C延伸10min。
65/6页 结果菌株在PDA培养基上培养4d后菌落直径超过2.5cm， 10d达6 7cm ; 在室温(26t:)下，菌丝生长良好，棉絮状至绒毛状，最初白色，逐渐中央粉色，后期转 变为紫色，培养基反面深紫色；菌丝有隔，分枝，透明，直径1.5 3.5ym，产生。
有大小分生包子小型分生孢子数量较多，从菌丝的侧生而单出的瓶状小梗上 长出或从分生孢子梗上长出，不呈链生而是假头状着生；椭圆形、纺锤形、卵形、逗点 形；具0 1隔，透明，光滑；大型分生孢子时常较少，产于粘孢团中或从分生孢子梗 上长出；镰刀形、纺锤形；顶端细胞窄细，稍尖；孢壁薄；大多3分隔，少为5分隔。 厚垣孢子生于菌丝中间或顶部，单生或串生，球形至卵形，光滑，直径5 10iim，在菌 丝上形成较稀疏。鉴定结果为尖孢镰刀菌。 序列表尖孢镰刀菌Fusarium xysporumCS-28的18s rDNA转录间区 (Internaltranscribedspacer， ITS)的序列结果 1 TGATATGCTT AAGTTCAGCG GGTATTCCTA CCTGATCCGA GGTCAACATT CAGAAGTTGG 61 GGGTTTAACG GCTTGGCCGC GCCGCGTTCC AGTTGCGAGG GTTTTACTAC TACGCAATGG 121 AGGCTGCAGC GAGACCGCCA CTAGATTTCG GGGCCGGCTT GCCGCAAGGG CTCGCCGATC 181 CCCAACACCA AACCCGAGGG CTTGAGGGTT GAAATGACGC TCGAACAGGC ATGCCCGCCA 241 GAATACTGGC GGGCGCAATG TGCGTTCAAA GATTCGATGA TTCACTGAAT TCTGCAATTC 301 ACATTACTTA TCGCATTTTG CTGCGTTCTT CATCGATGCC AGAACCAAGA GATCCGTTGT 361 TGAAAGTTTT GATTTATTTA TGGTTTTACT CAGAAGTTAC ATATAGAAAC AGAGTTTAGG 421 GGTCCTCTGG CGGGCCGTCC CGTTTTACCG GGAGCGGGCT GATCCGCCGA GGCAACAAGT481 GGTATGTTCA CAGGGGTTTG GGAGTTGTAA ACTCGGTAAT
GATCCCTCCG CAGGT 序列表样例 <110>哈尔滨工业大学 <120>利用木糖发酵产生乙醇的丝状真菌及其制备方法
<160>1
<210>1
<211>536
<212>DNA <213>FusariumxysporamCS-28
<400>TGATATGCTT AAGTTCAGCG GGTATTCCTA CCTGATCCGA GGTCAACATTCAGAAGTTGG 1 GGGTTTAACG GCTTGGCCGC GCCGCGTTCC AGTTGCGAGG GTTTTACTAC TACGCAATGG 61 AGGCTGCAGC GAGACCGCCA CTAGATTTCG GGGCCGGCTT GCCGCAAGGG CTCGCCGATC 121 CCCAACACCA AACCCGAGGG CTTGAGGGTT GAAATGACGC TCGAACAGGC ATGCCCGCCA 181 GAATACTGGC GGGCGCAATG TGCGTTCAAA GATTCGATGA TTCACTGAAT TCTGCAATTC 241 ACATTACTTA TCGCATTTTG CTGCGTTCTT CATCGATGCC AGAACCAAGA GATCCGTTGT 301 TGAAAGTTTT GATTTATTTA TGGTTTTACT CAGAAGTTAC ATATAGAAAC AGAGTTTAGG 361
GGCAACAAGT 421 GGTATGTTCA CAGGGGTTTG GGAGTTGTAA ACTCGGTAAT GATCCCTCCG CAGGT 48权利要求
一种利用木糖发酵产生乙醇的丝状真菌，其特征在于所述的丝状真菌是于2009年03月16日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏登记号为CCTCCM209040，命名为尖孢镰刀菌CS-28(Fusarium xysporum CS-28)的菌株。
2. 根据权利要求1所述的利用木糖发酵产生乙醇的丝状真菌，其特征在于所述的尖孢 镰刀菌Fusariumxysporum CS-28的18srDNA转录间区为TGATATGCTT AAGTTCAGCG GGTATTCCTA CCTGATCCGA GGTCAACATT CAGAAGTTGG 1GGGTTTAACG GCTTGGCCGC GCCGCGTTCC AGTTGCGAGG GTTTTACTAC TACGCAATGG 61AGGCTGCAGC GAGACCGCCA CTAGATTTCG GGGCCGGCTT GCCGCAAGGG CTCGCCGATC 121CCCAACACCA AACCCGAGGG CTTGAGGGTT GAAATGACGC TCGAACAGGC ATGCCCGCCA 181GAATACTGGC GGGCGCAATG TGCGTTCAAA GATTCGATGA TTCACTGAAT TCTGCAATTC 241ACATTACTTA TCGCATTTTG CTGCGTTCTT CATCGATGCC AGAACCAAGA GATCCGTTGT 301TGAAAGTTTT GATTTATTTA TGGTTTTACT CAGAAGTTAC ATATAGAAAC AGAGTTTAGG 361GGTCCTCTGG CGGGCCGTCC CGTTTTACCG GGAGCGGGCT GATCCGCCGA GGCAACAAGT 421GGTATGTTCA CAGGGGTTTG GGAGTTGTAA ACTCGGTAAT GATCCCTCCG CAGGT 481。
3. —种制备根据权利要求1所述的利用木糖发酵产生乙醇的丝状真菌的制备方法，其 特征在于它包括以下步骤(1) 种子培养基每L培养液含木糖10g，黄豆面10g， NaN03 2g， CaCl2 O.lg， MgS04 0.2g， KH2P04 2g， pH值6.0 ;(2) 发酵培养基每L培养液含木糖加g，黄豆面10g， NaNO"g， CaCl20.1g， MgS04 0.2g， KH2P04 2g， pH值6.0 ;(3) 培养方法从斜面培养基中挑起少量菌丝与活化固体培养基中，3(TC培养7天， 用无菌水洗下孢子，按1X106个孢子每升接种于装有20ml种子培养液的100ml摇瓶中， 30°C 200rpm培养2天。(4) 发酵方法10X的接种量接种于装有50ml发酵培养基的100ml摇瓶在中，静止培 养6天，进行乙醇含量的测定；(5) 应用上述的培养基和方法进行木糖发酵试验，在2%的木糖发酵培养基中，乙醇 的最大浓度为5.89g/L，得到菌株，产量为0.295g/g。
全文摘要
本发明提供了一种利用木糖发酵产生乙醇的丝状真菌及其制备方法，本发明的微生物尖孢镰刀菌Fusarium xysporum CS-28是于2009年03月11日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏登记号为CCTCCM209040，命名为尖孢镰刀菌CS-28(Fusarium xysporumCS-28)的菌株。本发明的丝状真菌能直接利用木糖发酵产生乙醇，特别对纤维素水解后的可发酵糖类的充分利用提高良好途径。本发明的丝状真菌尖孢镰刀菌以木糖为原料进行发酵产生乙醇，最好的氮源是酵母提取物，但本发明的最好氮源选择与其乙醇产量相当的黄豆面，大大降低了原料成本，而且培养方式为静止培养(半好氧状态)省去了搅拌工序，减少了工艺成本，从而降低了生产成本。
文档编号C12R1/77GK101691539SQ200910071929
公开日2010年4月7日 申请日期2009年4月30日 优先权日2009年4月30日
发明者杨谦, 范金霞 申请人:哈尔滨工业大学