专利名称：天然抗菌剂鸭β-防御素9重组蛋白的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物材料的制备方法，具体涉及一种具有广谱抗菌作用的生物材料的 制备方法。
(二)
背景技术：
多年来，饲用抗生素被广泛地用于降低畜禽类发病率和维持健康。然而，长期使用抗 生素，尤其是人类常用抗生素会导致抗生素在畜产品中残留及细菌耐药性的产生，尔后通 过食物链威胁人类健康。另外，抗生素的长期使用还会导致畜产品风味变差，而养殖业的 发展在很大程度上依赖畜产品品质。因此，生产者们迫切需要一种既有效又有利于环保的 新方法来控制畜禽疾病、改善畜产品品质。禽抗菌肽属P-防御素类，为防御素三大亚类(a、 p与e)之一，为禽先天性免疫的重要组成部分，在禽的防御系统中发挥重要作用。由于抗 菌肽为机体内产生的天然成分，具有广谱抗菌、抗病毒和免疫增强作用，并且对机体无毒 害、无残留，因此，有望成为新的饲用添加剂服务于畜牧养殖业。然而，由于天然抗菌肽 分子量小，在机体内含量很少，分离提纯困难，故天然产量非常有限。化学合成与基因工 程为获得抗菌肽的主要手段。由于化学合成抗菌肽成本太高，因此，通过基因工程的方法 在特定宿主内大量表达抗菌肽不失为一条有效的途径。以抗菌肽的基因为基础，选择合适 的表达宿主，可以通过基因重组的方法体外大量表达抗菌肽，为研制新型抗菌肽饲料添加 剂开辟一条新的途径。鸭P-防御素(AvBD) 9重组蛋白为鸭体内天然存在的，含氨基酸残 基67个，具有广谱抗菌活性的小分子多肽。在体、内外具有广谱抗菌活性和免疫促进作用， 为本发明研究与应用提供了理论基础。
(三)
发明内容
本发明的目的在于提供一中具有广谱抗菌活性，并对温度和酸碱度有很高的稳定性的 鸭P-防御素9重组蛋白的制备方法。
本发明的目的是这样实现的 'l.根据已发表的禽P防御素基因序列设计特异性引物，上游引物5'-ATGAGAATCCTTTTCTTCCTTGTTGC-3'， 下游弓l物
5 '-TTAGG AGCTAGGTGCCC ATTTGC AGC-3';
2.采用RT-PCR方法从鸭肝脏组织中扩增鸭AvBD9基因 并克隆到pMD-T载体上，经序列测定确定其基因序列为
ATG AGA ATC CTT TTC TTC CTT GTT GCT GTT CTC TTC TTC CTC TTC CAG GCTGCT CCA GCT TAC AGC CAA GAA GAC GCT GAC ACC TTA GCA TGC AGG CAG AGC CAC GGC TCC TGC TCT TTT GTT GCA TGC CGT GCT CCT TCA GTT GAC ATT GGG
3. 根据鸭AvBD9基因序列特点，用EcoRI和Sail双酶切位点将鸭AvBD9基因亚克隆 到原核表达载体pGEX-6p-l中，构建重组表达载体PGEX-6p-l-AvBD9，将其转化大肠杆菌 BL21感受态细胞，Amp+筛选阳性克隆；
4. 含阳性重组质粒的大肠杆菌BL21单个菌落在Amp+ LB培养基中37'C振荡培养，待 OD值达到0.3-0.5时加入IPTG、终浓度为0.6mM进行诱导，诱导2-6小时内，每2小时 分别采lml菌样，并分别于4'C、 5000转离心5分钟，收获细菌沉淀，在沉淀中加入1/10 菌液体积的lxSDS凝胶上样缓冲液，煮沸5分钟，冰浴2分钟。
5. 经亲和层析柱纯化回收鸭AvBD9重组蛋白。
诱导表达后的鸭AvBD9融合蛋白进行SDS-PAGE分析鉴定，取处理过的样品15ul/孔， 进行SDS-PAGE电泳(积层胶浓度为5%，分离胶为12%)。电泳后，经考马斯亮蓝染色， 甲醇-冰乙酸脱色液脱色。再通过薄层灰度扫描，确定蛋白质的表达量。获得分子量30kD 的特异表达带，经蛋白质印迹分析，证明为鸭AvBD9特异蛋白。蛋白质的表达量为34%。
经亲和层析柱纯化回收鸭AvBD9重组蛋白在体外测定鸭AvBD9重组蛋白的抗菌作用 与理化特性，研究发现鸭AvBD9重组蛋白的有益效果有l)能抑杀多杀性巴氏杆菌、枯草 芽胞杆菌、猪致病性琏球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等菌，2)对温度和酸碱 度有很高的稳定性，在一20 100。C处理30min或pH3 12条件下处理30min，其杀金黄色 葡萄球菌活性不变。
本发明用分子生物学技术，从鸭体内克隆到鸭AvBD9基因，选用合适的表达宿主在体 外表达鸭AvBD9重组蛋白。进一歩研究发现，鸭AvBD9重组蛋白具有广谱抗菌活性，并 对温度和酸碱度有很高的稳定性。
图1为采用RT-PCR方法从鸭肝脏组织中扩增鸭AvBD9基因表达电泳图照片，图中DL Marker2000:从上到下依次为2000bp， 1000 bp， 750 bp， 500 bp， 250 bp， 100 bp， 1:鸭 AvBD9， M: Marker;
图2为鸭AvBD9重组蛋白表达SDS-PAGE电泳图照片，其中1-3为IPTG诱导2h， 4h， 6h 后表达的pGEX-6p-l-AvBD9融合蛋白(30kD)， 4为阴性对照，M为protein Maker, 5和6 为纯化的pGEX-6p-l-AvBD9; Marker:从上到下依次为(KDa): 35.0， 25.0; 图3为鸭AvBD9重组蛋白抗菌图；图4-图5为鸭AvBD9重组蛋白在不同温度和pH条件下处理30min后的抗金黄色葡萄球菌 图，其中图4为温度处理，图5为PH值处理。 具体实施例方式
下面结合附图举例对本发明作更详细的描述
1. 根据已发表的禽(3防御素基因序列设计特异性引物，上游引物5'-ATGAGAATCCTTTTCTTCCTTGTTGC-3'， 下游弓l物
5 '陽TTAGGAGCTAGGTGCCC ATTTGC AGC-3';
2. 采用RT-PCR方法从鸭肝脏组织中扩增鸭AvBD9基因并克隆到pMD-T载体上，经序 列测定确定为鸭AvBD9基因
ATG AGA ATC CTT TTC TTC CTT GTT GCT GTT CTC TTC TTC CTC TTC CAG GCT GCT CCA GCT TAC AGC CAA GAA GAC GCT GAC ACC TTA GCA TGC AGG CAG AGC CAC GGC TCC TGC TCT TTT GTT GCA TGC CGT GCT CCT TCA GTT GAC ATT GGG
3. 原核表达载体的构建根据鸭AvBD9基因序列特点，用EcoRI和Sail双酶切位点 将鸭AvBD9基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-l中，构建重组表达载体 pGEX-6p-l-AvBD9，将其转化大肠杆菌BL21感受态细胞，Amp+筛选阳性克隆。小量法 提取质粒进行酶切和PCR鉴定后送交上海生物工程公司进行序列测定。
4. 鸭AvBD9融合蛋白的诱导表达含阳性重组质粒的大肠杆菌BL21单个菌落在Amp+ LB培养基中37'C振荡培养。待OD值达到0.3-0.5时加入IPTG(终浓度为0.6mM)进行诱导。 诱导诱导2-6小时内，每2小时分别采lml菌样，并分别于4'C、 5000转离心5分钟，收 获细菌沉淀。在沉淀中加入1/10菌液体积的lxSDS凝胶上样缓冲液，煮沸5分钟，冰浴2 分钟。
5. SDS-PAGE分析鉴定取处理过的样品15ul/孔，进行SDS-PAGE电泳(积层胶浓度 为5%，分离胶为12%)。电泳后，经考马斯亮蓝染色，甲醇-冰乙酸脱色液脱色。再通过薄 层灰度扫描，确定蛋白质的表达量。获得分子量30kD的特异表达带,经蛋白质印迹分析， 证明为鸭AvBD9特异蛋白。蛋白质的表达量为34%。
6. 经亲和层析柱纯化回收鸭AvBD9重组蛋白(试剂盒采用GST.Bind KitsNovagen，
Meliate of Inc. an A rck KgaA, Darmstadt, Germany),并在体外测定鸭AvBD9重组蛋白的抗
菌与理化特性，研究发现鸭AvBD9重组蛋白l)能抑杀多杀性巴氏杆菌、枯草芽胞杆菌、
猪致病性琏球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等菌，2)对温度和酸碱度有很高的
稳定性，在一20 100。C处理30min或pH3 12条件下处理30min,其杀金黄色葡萄球菌活性不变。 基因序列表
CCA GCT
GGC TCC TGC TCT TTT GTT GCA TGC CGT GCT CCT TCA GTT GAC ATT GGG ACC
推导的氨基酸序列表:
CKWAPSS -序列表样例
<110>东北农业大学
<120>天然抗菌剂鸭6-防御素9重组蛋白的制备方法
<140>
<141> 2009 - 04 - 30
:160> 1
<210> 1
<211> 204
<212> cDNA
<213>鸭(Anas platyrhynchos )
<400> 1
ATG AGA ATC CTT TTC TTC CTT GTT GCT GTT CTC TTC TTC CTC TTC CAG GCT GCT
CAG AGC CAC
GGC TCC TGC TCT TTT GTT GCA TGC CGT GCT CCT TCA GTT GAC ATT GGG ACC
权利要求
1、一种天然抗菌剂鸭β-防御素9重组蛋白的制备方法，其特征在于(1)根据已发表的禽β防御素基因序列设计特异性引物，上游引物5′-ATGAGAATCCTTTTCTTCCTTGTTGC-3′，下游引物5′-TTAGGAGCTAGGTGCCCATTTGCAGC-3′；(2)采用RT-PCR方法从鸭肝脏组织中扩增鸭AvBD9基因并克隆到pMD-T载体上，经序列测定得如下基因序列ATG AGA ATC CTT TTC TTC CTT GTT GCT GTT CTC TTC TTC CTC TTC CAG GCT GCTCCA GCT TAC AGC CAA GAA GAC GCT GAC ACC TTA GCA TGC AGG CAG AGC CACGGC TCC TGC TCT TTT GTT GCA TGC CGT GCT CCT TCA GTT GAC ATT GGG ACC TGCCGT GGT GGG AAG CTG AAA TGC TGC AAA TGG GCA CCT AGC TCC TAA(3)根据鸭AvBD9基因序列特点，用EcoRI和SalI双酶切位点将鸭AvBD9基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中，构建重组表达载体pGEX-6p-1-AvBD9，将其转化大肠杆菌BL21感受态细胞，Amp+筛选阳性克隆；(4)含阳性重组质粒的大肠杆菌BL21单个菌落在Amp+LB培养基中37℃振荡培养，待OD值达到0.3-0.5时加入IPTG、终浓度为0.6mM进行诱导，诱导2-6小时内，每2小时分别采1ml菌样，并分别于4℃、5000转离心5分钟，收获细菌沉淀，在沉淀中加入1/10菌液体积的1×SDS凝胶上样缓冲液，煮沸5分钟，冰浴2分钟，进行SDS-PAGE分析鉴定，取处理过的杆品15ul/孔，进行SDS-PAGE电泳，积层胶浓度为5％，分离胶为12％，电泳后，经考马斯亮蓝染色，甲醇-冰乙酸脱色液脱色，再通过薄层灰度扫描，确定蛋白质的表达量，获得分子量30kD的特异表达带，经蛋白质印迹分析，证明为鸭AvBD9特异蛋白，蛋白质的表达量为34％；(5)经亲和层析柱纯化回收鸭AvBD9重组蛋白，并在体外测定鸭AvBD9重组蛋白的抗菌作用与理化特性，研究发现鸭AvBD9重组蛋白1)能抑杀多杀性巴氏杆菌、枯草芽胞杆菌、猪致病性琏球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等菌；2)对温度和酸碱度有很高的稳定性，在-20～100℃处理30min或pH 3～12条件下处理30min，其杀金黄色葡萄球菌活性不变。
全文摘要
本发明提供了一种鸭β-防御素9重组蛋白的制备方法。本发明采用分子生物学技术，从鸭体内克隆到鸭β-防御素(AvBD)9基因，选用合适的表达宿主在体外表达鸭AvBD 9重组蛋白。进一步研究发现，鸭AvBD 9重组蛋白具有广谱抗菌活性和免疫促进作用。采用本发明的方法得到的重组鸭AvBD 9重组蛋白的有益效果有1)能抑杀多杀性巴氏杆菌、枯草芽胞杆菌、猪致病性琏球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等菌；2)对温度和酸碱度有很高的稳定性，在-20～100℃处理30min或pH 3～12条件下处理30min，其杀金黄色葡萄球菌活性不变。
文档编号C12P21/02GK101538583SQ200910071928
公开日2009年9月23日 申请日期2009年4月30日 优先权日2009年4月30日
发明者刘胜旺, 廖文燕, 韩宗玺, 马得莹 申请人:东北农业大学