专利名称：天然抗菌剂鸭β-防御素2重组蛋白的制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种生物材料的制备方法，具体地说是一种具有广谱抗菌作用的生物 材料的制备方法。
(二)
背景技术：
禽类是众多人畜共患病，如沙门氏菌、禽流感等病原的携带者，这些病原不仅是造成 畜产品污染的原因之一，同时也严重威胁人、畜的健康。因此，保证禽类健康，最大潜力 地发挥其先天性免疫功能，对维护人、畜健康，提高禽类的生产性能与禽产品安全性等都 有重要意义。抗菌肽也称为肽类抗生素或天然抗生素，是生物体产生的一类具有广谱抗菌 活性的小分子多肽。抗菌肽在自然界分布极为广泛，广泛地存在于细菌、植物、脊椎和无 脊椎动物中，是天然免疫的重要效应分子。由于抗菌肽为机体内产生的天然成分，具有广 谱抗菌、抗病毒和免疫增强作用，并且对机体无毒害、无残留，因此，有望成为新的饲用 添加剂服务于畜牧养殖业。鸭AvBD2重组蛋白为鸭体内天然存在的，含氨基酸残基65个， 具有广谱抗菌活性的小分子多肽。在体、内外具有广谱抗菌活性和免疫促进作用，为本发 明研究与应用提供了理论基础。
(三)
发明内容
本法明的目的在于提供一中具有广谱抗菌活性，并对温度和酸碱度有很高的稳定性的 鸭P-防御素2重组蛋白的制备方法。 本发明的目的是这样实现的-.
1. 根据已发表的禽p-防御素基因序列设计特异性引物，上游引物 5'-TGGCTCAGCAGATCTGCA-3'，下游弓l物5'-CGCAATGGCAATTTATTC-3、；
2. 采用RT-PCR方法从鸭胰腺组织中扩增鸭AvBD2基因并克隆到pMD-T载体上，经序 列测定确定其基因序列为
atgaggatcc tttacctgct cttctctgtc cttttcctgg tgctccaggt ttctccagga ttgtctttgc cccagcggga catgtttctc' tgtaggaaag gctcctgcca cttcggaaga tgtcccatcc acctgatcag agttggaagc tgctttgggt tccgctcctg ctgcaaatcg ccatgggatg tataa
3. 根据鸭AvBD2基因序列特点，用EcoRI和Sail双酶切位点将鸭AvBD2基因亚克隆 到原核表达载体pGEX-6p-l中，构建重组表达载体pGEX-6p-l-AvBD2，将其转化大肠杆菌 BL21感受态细胞，Amp+筛选阳性克隆；
4. 含阳性重组质粒的大肠杆菌BL21单个菌落在Amp+ LB培养基中37'C振荡培养，待OD值达到0.3-0.5时加入IPTG、终浓度为0.6mM进行诱导，诱导2-7小时内，每小时分 别采lml菌样，并分别于4'C、 5000转离心5分钟，收获细菌沉淀，在沉淀中加入1/10菌 液体积的lxSDS凝胶上样缓冲液，煮沸5分钟，冰浴2分钟。 5.经亲和层析柱纯化回收鸭AvBD2重组蛋白。
诱导表达后的鸭AvBD2融合蛋白进行SDS-PAGE分析鉴定，取处理过的样品15ul/孑L, 进行SDS-PAGE电泳(积层胶浓度为5%，分离胶为12%)。电泳后，经考马斯亮蓝染色， 甲醇-冰乙酸脱色液脱色。再通过薄层灰度扫描，确定蛋白质的表达量。获得分子量30kD 的特异表达带,经蛋白质印迹分析，证明为鸭AvBD2特异蛋白。蛋白质的表达量为40%。
经亲和层析柱纯化回收鸭AvBD2重组蛋白在体外测定鸭AvBD2重组蛋白的抗菌作用 与理化特性，研究发现鸭AvBD2重组蛋白的有益效果有l)能抑杀多杀性巴氏杆菌、枯草 芽胞杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等菌，2)对温度和酸碱度有很高的稳定性， 在一20 10(TC处理30min或pH 3 12条件下处理30min，其杀菌活性不变。
本发明采用分子生物学技术，从鸭体内克隆到鸭AvBD2基因，选用合适的表达宿主在 体外表达鸭AvBD2重组蛋白。进一步研究发现，鸭AvBD2重组蛋白具有广谱抗菌活性， 并对温度和酸碱度有很高的稳定性。
(四)
图1为采用RT-PCR方法从鸭胰腺组织中扩增鸭AvBD2基因表达电泳图照片，图中DL Marker2000:从上到下依次为2000bp， 1000 bp， 750 bp， 500 bp， 250 bp， 100 bp， 1:鸭 AvBD2， M: Marker;
图2为鸭AvBD2重组蛋白表达SDS-PAGE电泳图照片，图中1-6为IPTG诱导2-7h后 表达的pGEX-6p-l-AvBD2融合蛋白(30kD)， 7为pGEX空载体(26kD) 8为阴性对照，M 为protein Maker, 9为纯化的pGEX-6p-l-AvBD2; Marker:从上到下依次为(KDa): 35.0， 25.0;
图3-图7为鸭AvBD2重组蛋白抗菌图，图3为枯草芽孢杆菌，图4为金黄色葡萄球菌， 图5为多杀性巴氏杆菌，图6为大肠杆菌，图7为猪霍乱沙门氏菌；
图8-图9为鸭AvBD2重组蛋白在不同温度和pH条件下处理30min后的抗金黄色葡萄 球菌图，图8为温度处理，图9为PH值处理。
具体实施方式
下面结合附图举例对本发明作更详细的描述
1. 根据已发表的禽(3防御素基因序列设计特异性引物，上游引物 5'-TGGCTCAGCAGATCTGCA-3'，下游引物5'-CGCAATGGCAATTTATTC-3、；
2. 采用RT-PCR方法从鸭胰腺组织中扩增鸭AvBD2基因并克隆到pMD-T载体上，经序列测定确定为鸭AvBD2基因
atgaggatcc tttacctgct cttctctgtc cttttcctgg tgctccaggt ttctccagga ttgtctttgc cccagcggga catgtttctc tgtaggaaag gctcctgcca cttcggaaga tgtcccatcc acctgatcag agttggaagc tgctttgggt tccgctcctg ctgcaaatcg ccatgggatg tataa
3. 原核表达载体的构建根据鸭AvBD2基因序列特点，用EcoRI和Sail双酶切位点将 鸭AvBD2基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-l中，构建重组表达载体 pGEX-6p-l-AvBD2，将其转化大肠杆菌BL21感受态细胞，Amp+筛选阳性克隆。小量法 提取质粒进行酶切和PCR鉴定后送交上海生物工程公司进行序列测定。
4. 鸭AvBD2融合蛋白的诱导表达含阳性重组质粒的大肠杆菌BL21单个菌落在Amp+ LB培养基中37'C振荡培养。待OD值达到0.3~0.5时加入IPTG(终浓度为0.6mM)进行诱导。 诱导诱导2-7小时内，每小时分别采lml菌样，并分别于4'C、 5000转离心5分钟，收获 细菌沉淀。在沉淀中加入1/10菌液体积的lxSDS凝胶上样缓冲液，煮沸5分钟，冰浴2分 钟。
5. SDS-PAGE分析鉴定取处理过的样品15ul/孔，进行SDS-PAGE电泳(积层胶浓度 为5%，分离胶为12%)。电泳后，经考马斯亮蓝染色，甲醇-冰乙酸脱色液脱色。再通过薄 层灰度扫描，确定蛋白质的表达量。获得分子量30kD的特异表达带,经蛋白质印迹分析， 证明为鸭AvBD2特异蛋白。蛋白质的表达量为38%。
6. 经亲和层析柱纯化回收鸭AvBD2重组蛋白(试剂盒釆用GST.Bind KitsNovagen, Meliate of Inc. an A rck KgaA, Darmstadt, Germany),并在体外测定鸭AvBD2重组蛋白的抗 菌与理化特性，研究发现鸭AvBD2重组蛋白l)能抑杀多杀性巴氏杆菌、枯草芽胞杆菌、 大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等菌；2)对温度和酸碱度有很高的稳定性，在_20 IO(TC处理30min或pH 3 12条件下处理30min，其杀菌活性不变。
基因序列表
atgaggatcc tttacctgct cttctctgtc cttttcctgg tgctccaggt ttctccagga ttgtctttgc cccagcggga catgtttctc tgtaggaaag gctcctgcca cttcggaaga tgtcccatcc acctgatcag agttggaagc tgctttgggt tccgctcctg ctgcaaatcg ccatgggatg tataa
推导的氨基酸序列表:
WDV一、 申请发明专利或实用新型专利必须提交说明书， 一式两份(原件及复印件各一份)。
二、 说明书应当打字或者印刷，字迹应该整齐清晰，黑色，符合制版要求，字高在0.35厘 米至0.45厘米之间，行距在0.25厘米至0.35厘米之间。说明书首页用此页，续页可用同样 大小和质量相当的白纸续写。纸张纵向使用，只限使用正面，四周应当留有空白左侧和 顶部各2.5厘米，右侧和底部各1.5厘米。
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技术领域 (正文内容) 背景技术 (正文内容)
发明内容
(正文内容)
(正文内容)具体实施方式
(正文内容)
说明书如无附图，说明书文字部分就不包括
及其与其相应的小标题。
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六、 涉及核苷酸或氨基酸的申请，应当将该序列表作为说明书的一个单独部分，申请人应 当在申请的同时，提交与该序列表相一致的光盘或软盘，该光盘或软盘应符合专利局的有 关规定。
七、 说明书在两页以上的应当在每页下框线居中顺序编写页码。序列表样例
<110>东北农业大学
"20天然抗菌剂鸭p-防御素2重组蛋白的制备方法 <140>
<141> 2009 - 04 - 30 <160> 1 <210> 1 <211> 195 <212> cDNA
<213>鸭(Anas platyrhynchos ) <400> 1
atgaggatcc tttacctgct cttctctgtc cttttcctgg tgctccaggt ttctccagga ttgtctttgc cccagcggga catgtttctc tgt3gga3ag gctcctgcca cttcggaaga tgtcccatcc acctgatcag agttggaagc tgc卿ggt tccgctcctg ctgcaaatcg ccatgggatg tatas
权利要求
1、一种大然抗菌剂鸭β-防御素2重组蛋白的制备方法，其特征在于(1)根据已发表的禽β防御素基因序列设计特异性引物，上游引物5`-TGGCTCAGCAGATCTGCA-3`，下游引物5`-CGCAATGGCAATTTATTC-3`；(2)采用RT-PCR方法从鸭胰腺组织中扩增鸭AvBD2基因并克隆到pMD-T载体上，经序列测定得如下基因序列atgaggatcc tttacctgct cttctctgtc cttttcctgg tgctccaggt ttctccagga ttgtctttgc cccagcggga catgtttctctgtaggaaag gctcctgcca cttcggaaga tgtcccatcc acctgatcag agttggaagc tgctttgggt tccgctcctg ctgcaaatcgccatgggatg tataa(3)根据鸭AvBD2基因序列特点，用EcoRI和SalI双酶切位点将鸭AvBD2基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中，构建重组表达载体pGEX-6p-1-AvBD2，将其转化大肠杆菌BL21感受态细胞，Amp+筛选阳性克隆；(4)含阳性重组质粒的大肠杆菌BL21单个菌落在Amp+LB培养基中37℃振荡培养，待OD值达到0.3-0.5时加入IPTG、终浓度为0.6mM进行诱导，诱导2-7小时内，每小时分别采1ml菌样，并分别于4℃、5000转离心5分钟，收获细菌沉淀，在沉淀中加入1/10菌液体积的1×SDS凝胶上样缓冲液，煮沸5分钟，冰浴2分钟，进行SDS-PAGE分析鉴定，取处理过的样品15ul/孔，进行SDS-PAGE电泳，积层胶浓度为5％，分离胶为12％，电泳后，经考马斯亮蓝染色，甲醇-冰乙酸脱色液脱色，再通过薄层灰度扫描，确定蛋白质的表达量，获得分子量30kD的特异表达带，经蛋白质印迹分析，证明为鸭AvBD2特异蛋白，蛋白质的表达量为38％；(5)经亲和层析柱纯化回收鸭AvBD2重组蛋白，并在体外测定鸭AvBD2重组蛋白的抗菌作用与理化特性，研究发现鸭AvBD2重组蛋白1)能抑杀多杀性巴氏杆菌、枯草芽胞杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等菌；2)对温度和酸碱度有很高的稳定性，在-20～100℃处理30min或pH 3～12条件下处理30min，其杀菌活性不变。
全文摘要
本发明提供了一种天然抗菌剂鸭β-防御素2重组蛋白的制备方法。本发明用分子生物学技术，从鸭体内克隆到鸭β-防御素(AvBD)2基因，选用合适的表达宿主在体外表达鸭AvBD2重组蛋白。进一步研究发现，鸭AvBD 2重组蛋白具有广谱抗菌活性和免疫促进作用。采用本发明的方法得到的重组鸭AvBD 2重组蛋白的有益效果有1)能抑杀多杀性巴氏杆菌、枯草芽胞杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等菌；2)对温度和酸碱度有很高的稳定性，在-20～100℃处理30min或pH 3～12条件下处理30min，其杀菌活性不变。
文档编号C12P21/02GK101538582SQ20091007192
公开日2009年9月23日 申请日期2009年4月30日 优先权日2009年4月30日
发明者刘胜旺, 廖文燕, 王瑞琴, 韩宗玺, 马得莹 申请人:东北农业大学