专利名称：Rna介导的dna连接及在片延伸标记检测rna病毒方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域中病毒检测微阵列芯片的方法，具体为一种RNA介导的DNA连接及在片延伸标记检测RNA病毒方法。
背景技术：
病毒病害是一类重要病害，根据国际病毒分类委员会1995年的第六次 报告，现在已知的病毒有3600多种，它们分别属于71个病毒科目。病毒宿主广泛，将病毒分 为脊椎动物病毒、无脊椎动物病毒、昆虫病毒、植物病毒、细菌病毒等。单就植物病毒而言， 植物病毒共分为9个科(或亚科)，47个病毒属，729个种或可能种。其中DNA病毒1个科， 5个属，有105种。RNA病毒有8个科，42个属，624种，占病毒总数的85. 60%。单链RNA病 毒有583个种，占植物病毒总数的79. 9%。可见危害植物的病毒基本属于RNA病毒且单链 RNA病毒比例很高。主要常见的危害动物的麻疹病毒(Measles virus)、扎伊尔埃博拉病毒 (Zaire Ebola virus)、狂犬病毒(Rabies virus)，甲、乙、丙型、流感病毒(Influenza A、B、 C virus)、脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)、□蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)、 丁、甲、戊型月干炎病毒(Hepatitis delta、A、E、virus)、兔出血热病毒(rabbit hemorrhagic disease virus)、禽白血病毒(Avian leukemia virus)、HIV 病毒、腿腺炎病毒(Mumps virus)都属于RNA病毒。在分子水平上，动物和植物病毒检测具有相似性，这里主要以植物 病毒检测为主进行论述。植物病毒病害几乎在各类作物上都有发生，严重影响农作物的产量和质量，造成 农作物的大幅度的减产和品质的严重下降，全球每年由植物病毒造成的农作物直接损失为 200多亿美元，这还不包括地方特有的经济作物、野生和半野生资源型植物，也不包括植物 病毒引起作物品质下降造成的间接损失。重要的粮食作物(如小麦、马铃薯等)和经济作物 (如大豆、油菜、烟草、西红柿等)普遍遭受植物病毒的侵害。同时，植物病毒还严重危害果 树、花卉、药材和林木，导致种质退化和经济效益降低，无性繁殖作物感染病毒后，由于通过 营养繁殖连续传代，病毒不断积累，植物病毒的危害更为严重，给农业生产造成重大损失。对于植物病毒的感染，用一般的方法难以防治是生产上的一大难题，到目前为止， 还没有找到一种能有效地防治病毒病的化学药剂，在防治上除了选育对植物病毒有自然抗 性的品种和应用基因工程技术培育抗病毒的新品种外，生产上通常采用植物检疫手段来严 格控制各种途径的病毒传播和通过植物病毒的普查对感染病毒的植株进行隔离来控制病 毒的扩散，因此植物病毒的检测技术对控制病毒病的发生起着重要作用。最初植物病毒检 测主要依靠生物学性状，但生物学方法费时费力，检测周期长，而且易受环境条件的影响， 反应不稳定，重复性差。随着科学技术的发展，经科研工作者的不懈努力，已建立了多种植 物病毒的检测技术，虽然这些技术在病毒检测方面发挥着重要作用。主要有①指示植物鉴 定法，指示植物鉴定法的工作量大、时间长、灵敏度差，难以大量检测样本，有些病毒的寄主 范围很窄，没有合适的鉴定寄主；②电镜技术，电子显微镜技术需要一定技能，而且工作比 较集中，样本数量不易太大。依据病毒粒子的大小和弯曲程度一般只能判断到科或属。对 于球状病毒，因其形态相似很难直接利用电镜确定；③血清学技术(以病毒外壳蛋白为基 础)，主要包括ELISA、快速免疫滤纸测定、免疫胶体金技术、免疫毛细管区带电泳、免疫PCR 等，血清学检测的难点在于病毒的抗血清种类不全，抗血清的生产没有完全达到商品化、标准化。有时血清学上相关的病毒在核酸序列上并不完全同源，甚至没有同源性，从而导致在 利用血清学反应测定病毒的亲缘关系进行鉴定诊断时有可能出现偏差。④核酸检测，包括 PCR、分子信标、实时RT-PCR和核酸杂交等，PCR反应存在非特异性扩增缺陷，实验过程中可 能受到试剂中引物、模板等的污染，出现假阳性。因此单纯用PCR和RT-PCR方法进行病毒 检测的结果往往并不可靠。核酸杂交技术在进行核酸杂交时需要同位素或其它有毒有害物 质标记，同时，膜杂交只能是小批量样品进行处理，手工杂交需要较长的样品处理时间，目 前只是在某些研究条件下使用。由于上述各种用于植物病毒检测技术存在的种种缺陷与不 足，迄今尚未成为病毒检测的常规检测手段。 基因芯片技术为病毒的检测开辟了广阔的前景，因而受到国内外研究者的广泛关 注，虽然用芯片对不同病毒进行检测，但以往检测芯片在设计上，仍都采用PCR扩增获得探 针、反转录标记和在片杂交的方法进行病毒检测，操作过程繁琐，这使得在进行大量样本标 记时引物设计难度增加、耗时费力、引物之间相互干扰影响检测结果的正确性，严重影响病 毒检测芯片的商业化进程。因而病毒检测芯片迫切需要研究技术的创新。生物芯片技术为 病毒检测展现了良好的发展前景。生物芯片包括基因芯片、蛋白(多肽)芯片、多糖芯片和神经元芯片、细胞芯片、组 织原位芯片等种类。其中，基因芯片是最重要的一种生物芯片，也是目前研究最多的一种生 物芯片。基因芯片技术是基于碱基互补原理，在固体表面按一定的阵列集成大量的基因探 针，通过与待测基因进行杂交反应，进而对大量基因进行平行瞬时分析检测的技术。目前生物芯片的研究和开发种类逐渐趋于多样化，其应用生物芯片可实现对待检 样品中目标核酸分子、蛋白质分子、细胞、微小组织等物质的有无及多少进行准确、快速、大 信息量检测，具有微型化、高通量和自动化的检测特征。生物芯片在生物检测、医学检测及 疾病诊断、药物筛选和基因序列分析上有着极其重要的应用价值意义，因此受到广泛关注 和投资，使其已经成为一个全球性的新型产业，即生物芯片产业。
发明内容
本发明是提供一种成本低廉、制作方便、标准化、准确性高、便于程序 化加工制作的一种RNA介导的DNA连接及在片延伸标记检测RNA病毒方法，本发明的目 的是这样实现的由ICTV和GenBank中获得病毒基因组全序列，推断其保守性区域，用 DNAStar, DNAMan和Primer Primier 5. 0软件，设计长度44_50bp异性检测探针；检测探针是部分1和部分2合成，其部分1的3'端为羟基、连接处的5'端磷酸 化，部分1的3'端和5'端均为羟基，捕获探针(capture probe，CP)序列与检测探针的部 分1序列互补；所有捕获探针的5'端修饰NH2 (amino modifier C6)、3'端为羟基。固定在固体 基片表面固定，捕获探针既可作为在片聚合延伸的引物也可作为杂交探针用以捕获已连接 的检测探针；将化学合成的单链捕获探针通过微点样技术转移到化学修饰的玻片表面，借助其 5'端氨基连接到玻片表面，制备成捕获探针微阵列；以提取的由一种或两种以上病毒感染病株的靶RNA为连接模板(template)，用T4 连接酶连接检测探针；连接完成后，进行变性，加入RNase III降解、去除RNA ；用含有已连接检测探针及dUTP_Cy3、dATP、dCTP、dGTP的聚合酶反应混合物与制备的微阵列杂交，并进行在片延伸标记反应。特异性检测探针的制备是以样本的基因组核 糖核酸序列为基源，即信息载体。检测探针分两部分合成，捕获探针(capture probe, CP) 序列与检测探针部分1的序列互补。捕获探针5'端修饰有氨基点样于硅烷化处理的玻片 上与连接的检测探针杂交，用激光扫描仪进行扫描检测。于用5'端修饰有氨基的引物扩增 链用于固定在固相支持物包括拥有刚性和半刚性表面的材料。检测探针的连接是以RNA病 毒的基因组为模板，用T4连接酶连接。连接完成后，进行变性，需加入RNase III降解模板 RNA。
本发明的优点是便于在普通设备条件下病毒检测微阵列的方法。以病毒基因组 为信息载体设计特异性检测探针、以基于靶RNA (所检病毒RNA)为模板的检测探针的连接、 芯片杂交和在片DNA聚合酶延伸标记反应等实验，建立一种操作方便的病毒检测芯片方 法。本发明的优点还有1、本发明以病毒的遗传物质RNA作为检测的信息载体，以病毒基因 组序列为基础的特异性探针设计、筛选，为检测的准确性提供的物质基础。2、本发明以靶RNA为模板的检测探针的连接反应和在片DNA聚合酶延伸标记反应 检测RNA病毒。该发明突破以往检测芯片不能同时在片杂交和标记的局限，实现特异性杂 交、扩增和荧光标记。3、本发明用同一种病毒多重探针进行在片检测，极大地提高了芯片检测结果的可 靠性，使其检测的可控性和可靠性远远高于常规病毒检测方法。4、本发明所设计的检测探针和捕获探针均为可化学合成的寡核苷酸，探针获得与 制备更为方便，这不仅使该种芯片的制备成本大大降低，而且可以按照一定工艺批量生产， 其反应过程可望通过高度自动化的设备进行监控，有效地避免了常规病毒检测方法对不同 批次血清和指示物生长条件的依赖，因而便于建成标准化检测平台。一次制样可多次检测 病毒，而不像常规血清学方法那样需要针对每种病毒进行制样和重复检测，从而需要大量 样品、检测时间和人员设备。5、本发明的芯片配套材料可以在国内自主生产，可以有效减少对国外试剂的依 赖，改变多种病毒的抗血清和诊断试剂盒需要从国外购买的状况。6、本发明可检测植物、动物RNA病毒。该发明能够为国家口岸检疫提供必要的技 术保障，改变长期以来我国对一类、二类检疫病毒的检测关键技术依赖于国外技术标准和 检测材料的现状。
图1是检测探针化学合成结构原理示意图；图2提取的RNA为连接模板，T4DNA酶连接检测探针结构原理示意图；图3连接的检测探针与捕获探针制备的微阵列杂交并进行在片延伸反应结构原 理示意图。部分1的3'端为羟基、5'端为磷酸化，部分2的3'端和5'端均为羟基。
具体实施例方式由ICTV和GenBank中获得病毒基因组全序列，推断其保守性区域， 用DNAStar、DNAMan和Primer Primier 5. 0软件，设计长度44_50bp异性检测探针；检测探针是部分1和部分2合成，其部分1的3'端为羟基、连接处的5'端磷酸 化，部分1的3'端和5'端均为羟基，捕获探针(capture probe，CP)序列与检测探针的部 分1序列互补；所有捕获探针的5'端修饰NH2 (amino modifier C6)、3'端为羟基。固定在固体 基片表面固定，捕获探针既可作为在片聚合延伸的引物也可作为杂交探针用以捕获已连接的检测探针；将化学合成的单链捕获探针通过微点样技术转移到化学修饰的玻片表面，借助其 5'端氨基连接到玻片表面，制备成捕获探针微阵列；以提取的由一种或两种以上病毒感染病株的靶RNA为连接模板(template)，用T4 连接酶连接检测探针；连接完成后，进行变性，加入RNase III降解、去除RNA ；
用含有已连接检测探针及dUTP_Cy3、dATP、dCTP、dGTP的聚合酶反应混合物与制 备的微阵列杂交，并进行在片延伸标记反应。特异性检测探针的制备是以样本的基因组核 糖核酸序列为基源，即信息载体。检测探针分两部分合成，捕获探针(capture probe, CP) 序列与检测探针部分1的序列互补。捕获探针5'端修饰有氨基点样于硅烷化处理的玻片 上与连接的检测探针杂交，用激光扫描仪进行扫描检测。于用5'端修饰有氨基的引物扩增 链用于固定在固相支持物包括拥有刚性和半刚性表面的材料。检测探针的连接是以RNA病 毒的基因组为模板，用T4连接酶连接。连接完成后，进行变性，需加入RNase III降解模板 RNA。本发明的实施过程是1.RNA 的提取(1)取150到200毫克样本的叶子用液氮研磨。(2)用 1 毫升TRIZOL Reagent (Invitrogen，USA)溶解，加入 200 微升氯仿混勻， 其混合液在4°C、13000g离心15min。(3)上清液转到500微升异戊醇在-20°C温育20min并轻轻摇动，在4°C、12000g 离心IOmin0(4)沉淀用75%的乙醇洗涤，在4°C、7500g离心5min。(5) RNA沉淀风干后溶解在200微升蒸馏水中。(6)在实验中使用的所有材料包括器皿和溶液均用焦磷酸乙二酯(DEPC)处理。2.探针设计与合成在Genbank数据库中检索出所研究病毒的核酸序列，用BLAST (URL ;http://www. ncbi. nih. rov/BLAST/)在所研究的病毒核酸序列中进行比对搜寻特异性序列。检测探针序 列与病毒序列互补。每个检测探针分两部分进行化学合成，第一部分的3'端为羟基、5' 端为磷酸化，第二部分的3'端和5'端均为羟基。捕获探针(capture probe, CP)与检测 探针的第一部分互补。所有捕获探针的5'端修饰NH2(amin0 modifierC6) ,3‘端为羟基。 固定在固体基片表面固定。3.微阵列的制备(1)将洗净的破片置于95%的丙酮含2%的硅烷化试剂中5分钟，用丙酮洗涤两 次，75 °C烘烤45分钟。(2)氨基硅烷基片在戊二醛溶液(5% glutaraldehyde in 0. OlM PB at pH 7.0) 中泡30分钟，用蒸馏水洗涤两次后用氮气吹干。(3)将捕获探针溶解在碳酸钠缓冲液中(0. 1M，pH 9. 0)，然后点样，室温过夜， 37°C温育1小时。(4)玻片用 0. 28% (w/v)NaBH4/76% (v/v)PBS/24% (ν/ν)溶液泡 30 分钟，表面 剩余的醛基得以还原而钝化。后用双蒸水洗净吹干，4°C保存。
4.连接反应(1)每个连接反应得总体积为10 iil，其中含300nM提取的RNA，10 y m的每个检测 探针(parti and part2), 1XT4 ligase 缓冲液(500mM Tris-HCl, lOOmM MgCl2,20mM DTT and 0. 5mg/ml BSA)and 300u M ATP。(2)混合液在95°C温育3min，然后快速降到55°C温育3min。(3)加入0. 3U/u 1 T4DNA连接酶，在23°C温育3小时。(4)反应液在 ％°C变性 5min，加入 2 单位的 RNase III (Escherichia coli)降解 RNA模板。(5)在37°C温育30min，在85°C温育15min终止反应。5.在片聚合反应25ii LDNA 聚合酶混合液其中含有 50mM Tris-HCl (pH 7. 2), 10mM MgS04,0. ImM DTT,40uM of each dATP, Cy3-dUTP (Pharmacia, Piscataway, NJ), dGTP and dCTP, 20 u g/mlacetylated BSA, 5 u 1 连接混合物和 0. 5 ii 1 5U/u 1 Taq DNA 聚合酶在 95°C 变 性3min后，立即加到在55°C预热的微阵列上与其进行杂交反应。在延伸反应完成后，先用 2XSSC/0. 1% SDS洗涤，再用0. 2XSSC/0. 1% SDS洗涤，用去离子水洗涤10分钟。6.芯片的扫描与数据分析芯片在片延伸掺入的荧光信号通过芯片扫描仪ScanMicroarray Lite (Packard BiochipTechnologies)在 Cy3 波长下进行扫描，扫描条件为 80 % laser power, 75 % PMT gain，5iim分辨率。信号强度用QuantArray 微阵列分析软件(Packard Biochip Technologies)分析。样点的信号强度为扫描得到的信号强度减去背景荧光信号强度。
权利要求
RNA介导的DNA连接及在片延伸标记检测RNA病毒方法，其特征在于该检测方法包括如下步骤由ICTV和GenBank中获得病毒基因组全序列，推断其保守性区域，用DNAStar、DNAMan和Primer Primier 5.0软件，设计长度44-50bp异性检测探针；检测探针是部分1和部分2合成，其部分1的3′端为羟基、连接处的5′端磷酸化，部分1的3′端和5′端均为羟基，捕获探针(capture probe，CP)序列与检测探针的部分1序列互补；所有捕获探针的5′端修饰NH2(amino modifier C6)、3′端为羟基。固定在固体基片表面固定，捕获探针既可作为在片聚合延伸的引物也可作为杂交探针用以捕获已连接的检测探针；将化学合成的单链捕获探针通过微点样技术转移到化学修饰的玻片表面，借助其5′端氨基连接到玻片表面，制备成捕获探针微阵列；以提取的由一种或两种以上病毒感染病株的靶RNA为连接模板(template)，用T4连接酶连接检测探针；连接完成后，进行变性，加入RNase III降解、去除RNA；用含有已连接检测探针及dUTP-Cy3、dATP、dCTP、dGTP的聚合酶反应混合物与制备的微阵列杂交，并进行在片延伸标记反应。
2.根据权利要求1所述的一种RNA介导的DNA连接及在片延伸标记检测RNA病毒方 法，其特征在于特异性检测探针的制备是以样本的基因组核糖核酸序列为基源，即信息载 体。
3.根据权利要求1所述的一种RNA介导的DNA连接及在片延伸标记检测RNA病毒方 法，其特征在于检测探针分两部分合成，捕获探针(capture probe, CP)序列与检测探针 部分1的序列互补。
4.根据权利要求1所述的一种RNA介导的DNA连接及在片延伸标记检测RNA病毒方法， 其特征在于捕获探针5'端修饰有氨基点样于硅烷化处理的玻片上与连接的检测探针杂 交，用激光扫描仪进行扫描检测。
5.根据权利要求1所述的一种RNA介导的DNA连接及在片延伸标记检测RNA病毒方法， 其特征在于于用5'端修饰有氨基的引物扩增链用于固定在固相支持物包括拥有刚性和 半刚性表面的材料。
6.根据权利要求1所述的一种RNA介导的DNA连接及在片延伸标记检测RNA病毒方 法，其特征在于检测探针的连接是以RNA病毒的基因组为模板，用T4连接酶连接。
7.根据权利要求1所述的一种RNA介导的DNA连接及在片延伸标记检测RNA病毒方 法，其特征在于连接完成后，进行变性，需加入RNase III降解模板RNA。
全文摘要
本发明涉及生物医学领域中病毒检测微阵列芯片的方法，具体为一种RNA介导的DNA连接及在片延伸标记检测RNA病毒方法。其特点是以待检测病毒核酸序列为模板设计特异性检测探针，检测探针按两部分进行化学合成。如果“靶”病毒存在，则其检测探针的两部分可通过T4DNA连接酶连接。连接后的检测探针与固定在芯片上的其相应的捕获探针杂交，以连接后的检测探针为模板，以捕获探针为引物，进行在片DNA多聚酶聚合(包括Cy3-dUTP)反应产生荧光信号。如果“靶”病毒不存在，则无荧光信号产生。该方法检测的灵敏性比ELISA高十倍，检测的最小稀释浓度为万分之一(10□4，感染提取液/无感染提取液)。以病毒基因组为信息载体设计特异性检测探针、以基于靶RNA(所检病毒RNA)为模板的检测探针的连接、芯片杂交和在片DNA聚合酶延伸标记反应等实验，建立一种操作方便的病毒检测芯片方法。
文档编号C12R1/92GK101845512SQ200910071618
公开日2010年9月29日 申请日期2009年3月24日 优先权日2009年3月24日
发明者李同祥 申请人:李同祥