专利名称：可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮的细菌及筛选驯化方法
技术领域：
本发明涉及细菌及筛选驯化方法。
背景技术：
氨氮(NH3-N)以离子态氨(NH4+)和非离子态氨(NH3)两种形式存在于水中。 饮用水中氯化了的氨超过0.2mg/L会引起嗅味的问题，还会降低消毒效果， 氨在水管中，经亚硝化菌作用，生成亚硝酸盐，对人体健康带来危害。饮用水 中的难降解有机物难降解、易于通过食物链生物富集而放大其危害。
随着对异养硝化-好氧反硝化方面的研究逐步深入，并分离出大量的异养 型石肖化菌，如尸e"i^o附owos spp、 j/ca/fgewes faecalis、 7Tz/cwp/zaera pantotropha、 T7wwera mechernichensis等。但以上菌株处理过程中会发生出水中亚硝酸盐和 硝酸盐积累现象，对人体有危害，且会产生N20，对环境造成二次污染。名称 为"脱氮不动杆菌及其降解废水中氨氮的方法(中国专利号 ZL200410019474.7，申请日2004年06月04日，授权公告日2006年07月 26日)"的专利中公开了一株脱氮不动杆菌C4c/"eto&cter sp)YY-5， CGMCC No.1154，降解废水中氨氮的方法，可在好氧条件下将废水中的氨氮直接氧化 成氮气，但是该菌株应用时进水氨氮浓度均较高，最低时进水氨氮浓度也在 50mg/L以上，不适用于处理氨氮浓度在5mg/L以下的微污染水源水，而且在 降解氨氮时，控制温度为15 40°C，不适用于低温处理，如黑龙江省，年平 均气温最高只有4.9'C，而松花江每年有6个月以上的时间，水温处于1(TC以 下，因此在北方地区冬季时期应用上述菌种是难以达到处理要求的。《中国环 境科学》，2003; 23 (6): 644 647在研究低温下生物陶粒反应器去除水源水 中氨氮时虽然在低温条件下有较好的氨氮去除效果，但却导致了亚硝酸盐的大 量积累，对人体健康带来危害。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有细菌在去除水中有机物及氨氮时存在出水中亚硝酸盐和硝酸盐积累现象、产生N20对环境造成二次污染以及不适用于 处理微污染水源水和低温处理的问题，而提供可低温、好氧条件下同步去除微 污染水源水中有机物及氨氮的细菌及筛选驯化方法。
可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮的细菌SRA10 为鲁菲不动杆菌爿c/"e/o6acfer Avo^ /，属于不动杆菌属(^4c/"eto6acfer)，已在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo. 2889，保藏日期为2009年1月19日；低温、好氧条件下同步去除微污染水源 水中有机物及氨氮的细菌为革兰氏阴性好氧菌，为球状或短杆状，长为 1.5^im 2.5pm，宽为1.0|am 1.5|im，无芽孢和鞭毛，进行抽搐运动；在牛肉 膏蛋白胨培养基上形成乳白色菌落，菌落圆形，菌落表面隆起，光滑，菌落呈 粘性并附着于培养基。
可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮细菌的筛选驯 化方法按以下步骤实现 一、将微污染水源水在温度28 32i:、 150 170r/min 的好氧条件下富集培养48h后得富集液，富集液梯度稀释后涂布于LB固体培 养基上，在28 32'C的条件下分离培养48h，然后挑取特征不同的单菌落，分 别接种于LB固体培养基上纯化培养24h; 二、将纯化后的菌株接种于LB液 体培养基中，在28 32t的条件下培养24h后，得菌液；三、取lml菌液接 种于筛选培养基中，在28 32。C的条件下培养48h;四、取存活菌株的菌液 lml转接于新鲜的筛选培养基中，在28 32'C的条件下培养48h;五、重复步 骤四1 2次后取存活菌株接种于筛选培养基中进行逐步低温驯化，逐步低温 驯化是在20'C的条件下培养48h，驯化3代后取存活菌株的菌液lml接种于筛 选培养基中在15t:的条件下培养48h，驯化3代后再取存活菌株的菌液lml 接种于筛选培养基中在8"C的条件下培养48h，驯化3代后再取存活菌株的菌 液lml接种于筛选培养基中在6'C的条件下培养48h，驯化3代后再取存活菌 株的菌液lml接种于筛选培养基中在2°C的条件下培养48h，驯化3代；六、 取5ml2t:下低温驯化后存活菌株的菌液，在12000r/min转速下离心5min，取 沉淀物并加入lml无菌水制成悬浮液，然后加入含5g活性炭的50ml蒸馏水， 在2"C下固定48h后将固定有细菌的活性炭取出，再将固定有细菌的活性炭接 种于含5mg/L氨氮的无菌水中，在2'C、 140r/min的条件下振荡8h，然后取具有氨氮降解能力且不产生硝酸盐和亚硝酸盐的菌株接种于LB液体培养基中， 在2 1(TC的条件下培养24h得到菌液，取5ml菌液在12000r/min转速下离心 5min，取沉淀物并加入lml无菌水制成悬浮液，然后加入含5g活性炭的50ml 蒸馏水，在2。C下固定48h后将固定有细菌的活性炭取出，再将固定有细菌的 活性炭接种于微污染水源水中，在2'C、 140r/min的条件下振荡8h，选取总有 机碳降解能力最高的菌株，即为可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中 有机物及氨氮的细菌；其中步骤三中筛选培养基每1000mL由1.9g的Na2HPO4、 2.0g的KH2P04、 O.Olg的MgS04.7H20、 0.005g的CaCl2.2H20、 5.0g的NH4C1 和余量的水组成，pH值为6.0 8.0，所述余量的水为微污染水源水。
本发明中可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮的细 菌，接触酶阳性、氧化酶阴性、甲基红试验阴性、不产生乙酰甲基甲醇、不产 生HsS、不水解淀粉、不液化明胶、产生吲哚、生长pH值为6 8，生长温度 为2 30°C。
本发明中筛选驯化所得可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机 物及氨氮的细菌能在2 1(TC的低温条件下处理微污染水源水，氨氮降解率达 90%以上，有机物去除率达60% 70%，且无硝酸盐和亚硝酸盐积累，不产生 N20。
本发明中低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮的细菌 SRA10为鲁菲不动杆菌爿c/"Wo6ac/w /wo^ /，属于不动杆菌属04c/"etokzcfer)， 已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为 CGMCC No. 2889，保藏日期为2009年1月19日。
图1为具体实施方式
六中低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机 物及氨氮细菌的原子力显微镜观察图。
具体实施例方式
具体实施方式
一本实施方式可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水 中有机物及氨氮的细菌SRA10为鲁菲不动杆菌Jcz'"她6ac敏属于不动 杆菌属0^/恥tok^^0，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 保藏，保藏编号为CGMCCNo.2889，保藏日期为2009年1月19日；可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮的细菌为革兰氏阴性好氧
菌，为球状或短杆状，长为1.5[xm 2.5^im，宽为1.0|mi 1.5(im，无芽孢和鞭 毛，进行抽搐运动；在牛肉膏蛋白胨培养基上形成乳白色菌落，菌落圆形，菌 落表面隆起，光滑，菌落呈粘性并附着于培养基。
本实施方式中可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮 的细菌是根据《伯杰细菌鉴定手册》初步判定为不动杆菌属，然后经过 SHERLOCK微生物系统鉴定为鲁非氏不动杆菌属(Acinetobacter lwoffii)。
具体实施方式
二本实施方式与具体实施方式
二不同的是可低温、好氧条 件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮的细菌，接触酶阳性，氧化酶阴性； 甲基红试验阴性，不产生乙酰甲基甲醇；不产生H2S，不水解淀粉，不液化明 胶；产生吲哚；生长pH值为6 8，生长温度为2 3(TC。其它与具体实施方 式二相同。
具体实施方式
三本实施方式可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水 中有机物及氨氮细菌的筛选驯化方法按以下步骤实现 一、将微污染水源水在 温度28 32t:、 150 170r/min的好氧条件下富集培养48h后得富集液，富集 液梯度稀释后涂布于LB固体培养基上，在28 32。C的条件下分离培养48h， 然后挑取特征不同的单菌落，分别接种于LB固体培养基上纯化培养24h; 二、 将纯化后的菌株接种于LB液体培养基中，在28 32。C的条件下培养24h后， 得菌液；三、取lml菌液接种于筛选培养基中，在28 32'C的条件下培养48h; 四、取存活菌株的菌液lml转接于新鲜的筛选培养基中，在28 32"C的条件 下培养48h;五、重复步骤四1 2次后取存活菌株接种于筛选培养基中进行 逐步低温驯化，逐步低温驯化是在20'C的条件下培养48h，驯化3代后取存活 菌株的菌液lml接种于筛选培养基中在15'C的条件下培养48h，驯化3代后再 取存活菌株的菌液lml接种于筛选培养基中在8T:的条件下培养48h，驯化3 代后再取存活菌株的菌液lml接种于筛选培养基中在6。C的条件下培养48h， 驯化3代后再取存活菌株的菌液lml接种于筛选培养基中在2'C的条件下培养 48h，驯化3代；六、取5ml2"C下低温驯化后存活菌株的菌液，在12000r/min 转速下离心5min，取沉淀物并加入lml无菌水制成悬浮液，然后加入含5g活 性炭的50ml蒸馏水，在2"C下固定48h后将固定有细菌的活性炭取出，再将固定有细菌的活性炭接种于含5mg/L氨氮的无菌水中，在2'C、 140r/min的条件下振荡8h，然后取具有氨氮降解能力且不产生硝酸盐和亚硝酸盐的菌株接种于LB液体培养基中，在2 l(TC的条件下培养24h得到菌液，取5ml菌液在12000r/min转速下离心5min，取沉淀物并加入lml无菌水制成悬浮液，然后加入含5g活性炭的50ml蒸馏水，在2'C下固定48h后将固定有细菌的活性炭取出，再将固定有细菌的活性炭接种于微污染水源水中，在2'C、 140r/min的条件下振荡8h，选取总有机碳降解能力最高的菌株，即为可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮的细菌；其中步骤三中筛选培养基每1000mL由1.9g的Na2HP04、 2.0g的KH2P04、 O.Olg的MgS04.7H20、 0.005g的CaCb'2H20、 5.0g的NH4Cl和余量的水组成，pH值为6.0 8.0，所述余量的水为微污染水源水。
本实施方式步骤一中LB固体培养基在12rC下灭菌15 30min后使用。本实施方式步骤二中LB液体培养基在121'C下灭菌15 30min后使用。本实施方式步骤三中筛选培养基在121。C下灭菌15 30min后使用。本实施方式步骤四、五和六中的存活菌株为使筛选培养基中出现浑浊的菌株。
本实施方式步骤六中含5g活性炭的50ml蒸馏水在121'C下灭菌20 30min后使用。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
三不同的是步骤一中LB固体培养基每1000mL由10g的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、20g的琼脂、10gNaCl的和余量的水组成，pH值为6.0 8.0。其它步骤及参数与具体实施方式
三相同。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
四不同的是步骤二中LB液体培养基每1000mL由10g的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、10gNaCl的和余量的水组成，pH值为6.0 S.0。其它步骤及参数与具体实施方式
四相同。
具体实施方式
六本实施方式可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮细菌的筛选方法按以下步骤实现 一、将6个微污染水源水样分别在温度3(TC、 160r/min的好氧条件下富集培养48h后得富集液，富集液梯度稀释后涂布于LB固体培养基上，在30'C的条件下分离培养48h，然后挑
8取特征不同的单菌落，分别接种于LB固体培养基上纯化培养24h; 二、将纯化后的菌株接种于LB液体培养基中，在3(TC的条件下培养24h后，得菌液；三、取lml菌液接种于筛选培养基中，在3(TC的条件下培养48h;四、取存活菌株的菌液lml转接于新鲜的筛选培养基中，在3(TC的条件下培养48h;五、重复步骤四2次后取存活菌株接种于筛选培养基中进行逐步低温驯化，逐步低温驯化是在20'C的条件下培养48h，驯化3代后取存活菌株的菌液lml接种于筛选培养基中在15'C的条件下培养48h，驯化3代后再取存活菌株的菌液lml接种于筛选培养基中在8'C的条件下培养48h，驯化3代后再取存活菌株的菌液lml接种于筛选培养基中在6-C的条件下培养48h，驯化3代后再取存活菌株的菌液lml接种于筛选培养基中在2'C的条件下培养48h，驯化3代；六、取5ml2。C下低温驯化后存活菌株的菌液，在12000r/min转速下离心5min，取沉淀物并加入lml无菌水制成悬浮液，然后加入含5g活性炭的50ml蒸馏水，在2"C下固定48h后将固定有细菌的活性炭取出，再将固定有细菌的活性炭接种于含5mg/L氨氮的无菌水中，在2'C、 140r/min的条件下振荡8h，然后取具有氨氮降解能力且不产生硝酸盐和亚硝酸盐的菌株接种于LB液体培养基中，在2°C的条件下培养24h得到菌液，取5ml菌液在12000r/min转速下离心5min，取沉淀物并加入lml无菌水制成悬浮液，然后加入含5g活性炭的50ml蒸馏水，在2'C下固定48h后将固定有细菌的活性炭取出，再将固定有细菌的活性炭接种于微污染水源水中，在2°C、 140r/min的条件下振荡8h，选取总有机碳(TOC)降解能力最高的菌株，即为可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮的细菌；其中步骤三中筛选培养基每1000mL由1.9g的Na2HP04、2.0g的KH2P04、 O.Olg的MgS04'7H20、 0.005g的CaCl2'2H20、 5.0g的NH4CI和余量的水组成，pH值为6.0 8.0，所述余量的水为微污染水源水。
本实施方式步骤一中微污染水源水样为沿江(河)从上游至下游于江(河)中心处每隔10米分别取水，共取样6处。
本实施方式中筛选得到具体实施方式
一中的低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮的细菌，如图1所示，无鞭毛；经检测，在2X:的条件下处理微污染水源水，氨氮降解率达92%，有机物去除率达70%，且无硝酸盐和亚硝酸盐积累，不产生N20。
权利要求
1、可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮的细菌，其特征在于低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮的细菌SRA10为鲁菲不动杆菌Acinetobacter lwoffii，属于不动杆菌属(Acinetobacter)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.2889，保藏日期为2009年1月19日；低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮的细菌为革兰氏阴性好氧菌，为球状或短杆状，长为1.5μm～2.5μm，宽为1.0μm～1.5μm，无芽孢和鞭毛，进行抽搐运动；在牛肉膏蛋白胨培养基上形成乳白色菌落，菌落圆形，菌落表面隆起，光滑，菌落呈粘性并附着于培养基。
2、 根据权利要求1所述的可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中 有机物及氨氮的细菌，其特征在于低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中 有机物及氨氮的细菌，接触酶阳性、氧化酶阴性、甲基红试验阴性、不产生乙 酰甲基甲醇、不产生H2S、不水解淀粉、不液化明胶、产生n引哚、生长pH值 为6 8，生长温度为2 3(TC。
3、 筛选驯化可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮 细菌的方法，其特征在于低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及 氨氮的细菌的筛选驯化方法按以下步骤实现 一、将微污染水源水在温度28 32'C、 150 170r/min的好氧条件下富集培养48h后得富集液，富集液梯度稀 释后涂布于LB固体培养基上，在28 32。C的条件下分离培养48h，然后挑取 特征不同的单菌落，分别接种于LB固体培养基上纯化培养24h; 二、将纯化 后的菌株接种于LB液体培养基中，在28 32i:的条件下培养24h后，得菌液； 三、取lml菌液接种于筛选培养基中，在28 32。C的条件下培养48h;四、取 存活菌株的菌液lml转接于新鲜的筛选培养基中，在28 32'C的条件下培养 48h;五、重复步骤四1 2次后取存活菌株接种于筛选培养基中进行逐步低温 驯化，逐步低温驯化是在2(TC的条件下培养48h，驯化3代后取存活菌株的菌 液lml接种于筛选培养基中在15°C的条件下培养48h，驯化3代后再取存活菌 株的菌液lml接种于筛选培养基中在8'C的条件下培养48h，驯化3代后再取 存活菌株的菌液lml接种于筛选培养基中在6'C的条件下培养48h，驯化3代后再取存活菌株的菌液lml接种于筛选培养基中在2'C的条件下培养48h，驯 化3代；六、取5ml2'C下低温驯化后存活菌株的菌液，在12000r/min转速下 离心5min，取沉淀物并加入lml无菌水制成悬浮液，然后加入含5g活性炭的 50ml蒸馏水，在2"C下固定48h后将固定有细菌的活性炭取出，再将固定有细 菌的活性炭接种于含5mg/L氨氮的无菌水中，在2"C、 140r/min的条件下振荡 8h，然后取具有氨氮降解能力且不产生硝酸盐和亚硝酸盐的菌株接种于LB液 体培养基中，在2 l(TC的条件下培养24h得到菌液，取5ml菌液在12000r/min 转速下离心5min，取沉淀物并加入lml无菌水制成悬浮液，然后加入含5g活 性炭的50ml蒸馏水，在2"C下固定48h后将固定有细菌的活性炭取出，再将 固定有细菌的活性炭接种于微污染水源水中，在2'C、 140r/min的条件下振荡 8h，选取总有机碳降解能力最高的菌株，即为可低温、好氧条件下同步去除微 污染水源水中有机物及氨氮的细菌；其中步骤三中筛选培养基每1000mL由 1.9g的Na2HPO4、2.0g的KH2PO4、0.01g的MgSO4'7H2O、0.005g的CaCl2'2H20、 5.Og的NH4Cl和余量的水组成，pH值为6.0 8.0，所述余量的水为微污染水 源水。
4、 根据权利要求3所述的可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中 有机物及氨氮细菌的筛选驯化方法，其特征在于步骤一中LB固体培养基每 lOOOmL由10g的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、20g的琼脂、10gNaCl的和余量 的水组成，pH值为6.0 8.0。
5、 根据权利要求4所述的可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中 有机物及氨氮细菌的筛选驯化方法，其特征在于步骤二中LB液体培养基每 lOOOmL由10g的胰蛋白胨、5g的酵母浸粉、10gNaCl的和余量的水组成，pH 值为6.0 8.0。
全文摘要
可低温、好氧条件下同步去除微污染水源水中有机物及氨氮的细菌及筛选驯化方法，它涉及细菌及筛选驯化方法。它解决了现有细菌不适用于处理微污染水源水和低温处理的问题。本发明细菌SRA10为鲁菲不动杆菌，属于不动杆菌属，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.2889，保藏日期为2009年1月19日。筛选方法一、分离纯化；二、制菌液；三、菌液筛选培养；四、取存活菌株的菌液筛选培养；五、重复步骤四1～2次后取存活菌株进行逐步低温驯化；六、取低温驯化后存活菌株的菌液，复筛后即得。本发明中筛选驯化所得细菌能在2～10℃的低温条件下处理微污染水源水。
文档编号C12R1/01GK101503665SQ20091007157
公开日2009年8月12日 申请日期2009年3月18日 优先权日2009年3月18日
发明者张多英, 李伟光, 王广智, 解丰波, 郜玉楠 申请人:哈尔滨工业大学