专利名称：一种降解木质纤维素类生物质产氢细菌的筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种产氢细菌的筛选方法。
背景技术：
能源短缺和环境污染是人类面临的重大挑战，生物制氢技术是解决这一问 题的重要手段之一，氢气作为清洁可再生能源已成为当今能源和环境领域中的 热点研究。降解木质纤维素类生物质产氢细菌利用秸秆类农林业废弃物产氢， 具有产能效率高、能耗低、环保治污、成本低等特点，发展潜力巨大，为处理 农林业有机废弃物，实现资源、能源、环境和经济的可持续发展具有现实意义。 以往筛选纤维素降解产氢菌时，多从生物制氢反应器中获得菌源，由于生物制 氢反应器中的底物多为有机废水，而有机废水对纤维素的针对性较差，所以筛 选得到的产氢菌不适合降解木质纤维素产氢工艺。
目前不能够从牛粪堆肥中筛选出降解纤维素的产氢菌，所以樊耀亭等人只 能以牛粪堆肥作为天然混合产氢菌来源，通过厌氧发酵制备生物氢气。由于牛 粪中含有的重金属和牛自身代谢的有毒物质降低了降解纤维素产氢菌的活性， 影响了产氢效果；加之牛粪堆肥中还含有多种不同类型的微生物，因此导致所 产生的气体中杂质多，氢气量少的问题，而且产氢工艺难以控制，容易导致其 他微生物成为优势菌群，从而影响降解纤维素产氢菌的活力，降低产氢量。
发明内容
本发明的目的是为了解决现在有机废水中筛选得到的产氢菌不适合降解 木质纤维素产氢工艺，而且以牛粪堆肥作为天然混合产氢菌来源制备氢气的方 法存在产生的气体中杂质多、氢气量少、工艺难以控制的问题，而提供一种降 解木质纤维素类生物质产氢细菌的筛选方法。
降解木质纤维素类生物质产氢细菌的筛选方法按以下步骤实现a、取10g 牛粪堆肥样品放入三角瓶中，加入生理盐水和数颗玻璃珠，在摇床上振荡 30min，然后取lmL上清液接种于CM3纤维素滤纸培养基中静置培养一周， 得菌体富集液；b、取lmL菌体富集液用厌氧的无菌水进行倍比稀释，再接种于CM3纤维素粉末固体培养基中，制成滚管，分离培养5 7天，然后挑取水 解透明圈菌落转接于CM3纤维素滤纸培养基中纯化培养3 4天，得纯菌株； c、纯菌株接种于CM3纤维素粉末固体培养基中，制成滚管，分离培养5 7 天，然后挑取水解透明圈菌落转接于CM3纤维素滤纸培养基中纯化培养3 4 天，再转接于CM3纤维二糖固体培养基中培养至得到单一菌落；d、将单一菌 落接种于CM3纤维素粉末液体培养基中，在37°C、 130r/min的条件下振荡培 养一周后检测气相，有氢气产生的即为降解木质纤维素类生物质产氢细菌；其 中步骤a中生理盐水为充入无菌氮气的生理盐水；步骤a中CM3纤维素滤纸 培养基是在改良CM3培养基中加入滤纸条；步骤b中CM3纤维素粉固体培 养基是在改良CM3琼脂培养基中加入纤维素粉；步骤c中CM3纤维二糖固体 培养基是在改良CM3琼脂培养基中加入纤维二糖；步骤d中CM3纤维素粉 液体培养基是在改良CM3培养基中加入pH-101纤维素粉。
本发明从牛粪堆肥中筛选得到降解木质纤维素类生物质产氢细菌，为严格 厌氧细菌。利用本发明方法得到的菌株在发酵中能够产生氢气，产氢量大、气 体中杂质少；由于本发明方法得到的菌株为纯菌株，所以利用其产氢工艺容易 控制。本发明方法得到的菌株对纤维素的针对性强，在降解纤维素的同时能够 同步产氢，适合应用在降解木质纤维素产氢工艺；本发明中降解木质纤维素类 生物质产氢细菌在菌种的一次纯化过程用时为3 4天，而现有技术中需要10 天 2周，最后筛选得到纯菌株的时间短，对于可再生生物质资源利用以及环 境保护具有重要的理论意义和工程应用价值。
图1为筛选所得降解木质纤维素类生物质产氢细菌的电镜图。
具体实施例方式
具体实施方式
一本实施方式降解木质纤维素类生物质产氢细菌的筛选方 法按以下步骤实现a、取10g牛粪堆肥样品放入三角瓶中，加入生理盐水和 数颗玻璃珠，在摇床上振荡30min，然后取lmL上清液接种于CM3纤维素滤 纸培养基中静置培养一周，得菌体富集液；b、取lmL菌体富集液用厌氧的无 菌水进行倍比稀释，再接种于CM3纤维素粉末固体培养基中，制成滚管，分 离培养5 7天，然后挑取水解透明圈菌落转接于CM3纤维素滤纸培养基中纯化培养3 4天，得纯菌株；c、纯菌株接种于CM3纤维素粉末固体培养基中， 制成滚管，分离培养5 7天，然后挑取水解透明圈菌落转接于CM3纤维素滤 纸培养基中纯化培养3 4天，再转接于CM3纤维二糖固体培养基中培养至得 到单一菌落；d、将单一菌落接种于CM3纤维素粉末液体培养基中，在37'C、 130r/min的条件下振荡培养一周后检测气相，有氢气产生的即为降解木质纤维 素类生物质产氢细菌；其中步骤a中生理盐水为充入无菌氮气的生理盐水；步 骤a中CM3纤维素滤纸培养基是在改良CM3培养基中加入滤纸条；步骤b中 CM3纤维素粉固体培养基是在改良CM3琼脂培养基中加入纤维素粉；步骤c 中CM3纤维二糖固体培养基是在改良CM3琼脂培养基中加入纤维二糖;步骤 d中CM3纤维素粉液体培养基是在改良CM3培养基中加入pH-101纤维素粉。 本实施方式步骤a中牛粪堆肥样品为菌种筛选源。 本实施方式步骤a中滤纸条裁剪的大小为宽lcmX长4cm。 本实施方式步骤b中改良CM3琼脂培养基中琼脂的加入量是占培养基总 质量的2%。
本实施方式步骤b中纤维素粉的加入量为铺满厌氧管圆底。 本实施方式步骤c中纤维二糖的加入量是占培养基总质量的1%。 本实施方式步骤d中pH-101纤维素粉的加入量为铺满厌氧管圆底。 本实施方式培养基中菌体的培养气相条件为氮气气氛。 本实施方式中筛选所得降解木质纤维素类生物质产氢细菌，如图l所示， 细菌为革兰氏阳性菌，细菌呈球形或卵圆形(宽0.6 2.01imx长0.6 2.5pm)， 在液体培养基中呈成对或短链，不生芽孢，有时以鞭毛运动，没有明显的荚膜。 本实施方式中筛选所得降解木质纤维素类生物质产氢细菌，在厌氧条件下 取15mL接种于150mLCM3纤维素粉末液体培养基中，在37°C、 130r/min的 条件下培养一周，测定其纤维素降解率为42.6%。
本实施方式中筛选所得降解木质纤维素类生物质产氢细菌，在厌氧条件下 取15mL接种于150mLCM3纤维素粉末液体培养基中，在37。C、 130r/min的 条件下培养一周，测定其发酵过程中产氢量，发酵至50 60h时，株菌累积产 氢量达到最大，产氢量为97.5ml/L，比纤维素降解率达到最大值的时间(30 40h)滞后，这点符合产氢细菌菌株的代谢特征的。
6本实施方式中筛选所得降解木质纤维素类生物质产氢细菌，以纤维素粉末 为唯一碳源，在静态厌氧培养条件下发酵纤维素，检测其液相末端产物，确定 其发酵类型属丙酸型发酵，这与难降解碳水化合物(如纤维素)的厌氧发酵过程 呈丙酸型发酵的特征相符。
具体实施方式
二本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤a中的改 良CM3培养基每1000mL由1.5g的KH2P04、 4.2g的Na2HP04*12H20、 0.5g 的NH4C1、 0.18g的MgCl2'6H20、 2.0g的酵母浸粉、0.5g的还原剂L-半胱氨 酸、2.00mL质量浓度为0.1%的氧化还原电位指示剂、10mL的微量元素液和 余量的水组成，pH值为6.8 7.2;所述的微量元素液每lOOOmL由O.Olg的维 生素B^、 0.025g的抗坏血酸、0.025g的核黄素、0.02g的柠檬酸、0.05g的口比 多辛、O.Olg的叶酸、O.Olg的对氨基苯甲酸、0.025g的肌酸、O.Olg的 MnS04'7H20、 0.05g的ZnS04'7H20、 O.Olg的H3B03、 O.Olg的N(CH2COOH)3、 O.Olg的CaCl2*2H20、 O.Olg的Na2MoO4、0.2g的CoCl2'6H20、 O.Olg的A1K(SQ4)2 和余量的水组成。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
二不同的是步骤a中滤纸 条为经过处理的滤纸裁剪而成，即采用质量浓度为1。/。的醋酸浸泡滤纸条24h， 然后用碘液检查确定无淀粉后，再用质量浓度为2%的苏打水冲洗滤纸条至中 性，晾干后裁剪。其它步骤及参数与具体实施方式
二相同。
具体实施方式
四本实施方式与具体实施方式
三不同的是步骤b中的改 良CM3琼脂培养基是在改良CM3培养基中加入琼脂。其它步骤及参数与具体 实施方式三相同。
具体实施方式
五本实施方式降解木质纤维素类生物质产氢细菌的筛选方 法按以下步骤实现a、取10g牛粪堆肥样品放入三角瓶中，加入生理盐水和 数颗玻璃珠，在摇床上振荡30min，然后取lmL上清液接种于CM3纤维素滤 纸培养基中静置培养一周，得菌体富集液；b、取lmL菌体富集液用厌氧的无 菌水进行倍比稀释，再接种于CM3纤维素粉末固体培养基中，制成滚管，分 离培养6天，然后挑取水解透明圈菌落转接于CM3纤维素滤纸培养基中纯化 培养3天，得纯菌株；c、纯菌株接种于CM3纤维素粉末固体培养基中，制成 滚管，分离培养5天，然后挑取水解透明圈菌落转接于CM3纤维素滤纸培养
7基中纯化培养4天，再转接于CM3纤维二糖固体培养基中培养至得到单一菌 落；d、将单一菌落接种于CM3纤维素粉末液体培养基中，在37'C、 130r/min 的条件下振荡培养一周后检测气相，有氢气产生的即为降解木质纤维素类生物 质产氢细菌；其中步骤a中生理盐水为充入无菌氮气的生理盐水；步骤a中 CM3纤维素滤纸培养基是在改良CM3培养基中加入滤纸条；步骤b中CM3 纤维素粉固体培养基是在改良CM3琼脂培养基中加入纤维素粉；步骤c中 CM3纤维二糖固体培养基是在改良CM3琼脂培养基中加入纤维二糖；步骤d 中CM3纤维素粉液体培养基是在改良CM3培养基中加入pH-101纤维素粉。
本实施方式中筛选所得降解木质纤维素类生物质产氢细菌，在厌氧条件下 取15mL接种于150mLCM3纤维素粉末液体培养基中，在37。C、 130r/min的 条件下培养一周，测定其纤维素降解率为40.8%。
本实施方式中筛选所得降解木质纤维素类生物质产氢细菌，在厌氧条件下 取15mL接种于150mLCM3纤维素粉末液体培养基中，在37"、 130r/min的 条件下培养一周，测定其发酵过程中产氢量，发酵至50 60h时，株菌累积产 氢量达到最大，产氢量为96.9ml/L，比纤维素降解率达到最大值的时间(30 40h)滞后，这点符合产氢细菌菌株的代谢特征的。
本实施方式中选择牛粪堆肥为菌种筛选源，筛选得到菌为严格厌氧细菌， 且在降解纤维素的同时能够同步产氢。
具体实施方式
六本实施方式降解木质纤维素类生物质产氢细菌的筛选方 法按以下步骤实现a、取10g牛粪堆肥样品放入三角瓶中，加入生理盐水和 数颗玻璃珠，在摇床上振荡30min，然后取lmL上清液接种于CM3纤维素滤 纸培养基中静置培养一周，得菌体富集液；b、取lmL菌体富集液用厌氧的无 菌水进行倍比稀释，再接种于CM3纤维素粉末固体培养基中，制成滚管，分 离培养5天，然后挑取水解透明圈菌落转接于CM3纤维素滤纸培养基中纯化 培养4天，得纯菌株；c、纯菌株接种于CM3纤维素粉末固体培养基中，制成 滚管，分离培养5天，然后挑取水解透明圈菌落转接于CM3纤维素滤纸培养 基中纯化培养4天，再转接于CM3纤维二糖固体培养基中培养至得到单一菌 落；d、将单一菌落接种于CM3纤维素粉末液体培养基中，在37i:、 130r/min 的条件下振荡培养一周后检测气相，有氢气产生的即为降解木质纤维素类生物质产氢细菌；其中步骤a中生理盐水为充入无菌氮气的生理盐水；步骤a中 CM3纤维素滤纸培养基是在改良CM3培养基中加入滤纸条；步骤b中CM3 纤维素粉固体培养基是在改良CM3琼脂培养基中加入纤维素粉；步骤c中 CM3纤维二糖固体培养基是在改良CM3琼脂培养基中加入纤维二糖；步骤d 中CM3纤维素粉液体培养基是在改良CM3培养基中加入pH-101纤维素粉。
本实施方式中筛选所得降解木质纤维素类生物质产氢细菌，在厌氧条件下 取15mL接种于150mLCM3纤维素粉末液体培养基中，在37°C、 130r/min的 条件下培养一周，测定其纤维素降解率为42.5%。
本实施方式中筛选所得降解木质纤维素类生物质产氢细菌，在厌氧条件下 取15mL接种于150mLCM3纤维素粉末液体培养基中，在37°C、 130r/min的 条件下培养一周，测定其发酵过程中产氢量，发酵至50 60h时，株菌累积产 氢量达到最大，产氢量为97.0ml/L，比纤维素降解率达到最大值的时间(30 40h)滞后，这点符合产氢细菌菌株的代谢特征的。
本实施方式中选择牛粪堆肥为菌种筛选源，筛选得到菌为严格厌氧细菌， 且在降解纤维素的同时能够同步产氢。
具体实施方式
七本实施方式降解木质纤维素类生物质产氢细菌的筛选方 法按以下步骤实现a、取10g牛粪堆肥样品放入三角瓶中，加入生理盐水和 数颗玻璃珠，在摇床上振荡30min，然后取lmL上清液接种于CM3纤维素滤 纸培养基中静置培养一周，得菌体富集液；b、取lmL菌体富集液用厌氧的无 菌水进行倍比稀释，再接种于CM3纤维素粉末固体培养基中，制成滚管，分 离培养7天，然后挑取水解透明圈菌落转接于CM3纤维素滤纸培养基中纯化 培养3天，得纯菌株；c、纯菌株接种于CM3纤维素粉末固体培养基中，制成 滚管，分离培养7天，然后挑取水解透明圈菌落转接于CM3纤维素滤纸培养 基中纯化培养3天，再转接于CM3纤维二糖固体培养基中培养至得到单一菌 落；d、将单一菌落接种于CM3纤维素粉末液体培养基中，在37C、 130r/min 的条件下振荡培养一周后检测气相，有氢气产生的即为降解木质纤维素类生物 质产氢细菌；其中步骤a中生理盐水为充入无菌氮气的生理盐水；步骤a中 CM3纤维素滤纸培养基是在改良CM3培养基中加入滤纸条；步骤b中CM3 纤维素粉固体培养基是在改良CM3琼脂培养基中加入纤维素粉；步骤c中
9CM3纤维二糖固体培养基是在改良CM3琼脂培养基中加入纤维二糖；步骤d 中CM3纤维素粉液体培养基是在改良CM3培养基中加入pH-101纤维素粉。
本实施方式中筛选所得降解木质纤维素类生物质产氢细菌，在厌氧条件下 取15mL接种于150mLCM3纤维素粉末液体培养基中，在37°C、 130r/min的 条件下培养一周，测定其纤维素降解率为42.2%。
本实施方式中筛选所得降解木质纤维素类生物质产氢细菌，在厌氧条件下 取15mL接种于150mLCM3纤维素粉末液体培养基中，在37。C、 130r/min的 条件下培养一周，测定其发酵过程中产氢量，发酵至50 60h时，株菌累积产 氢量达到最大，产氢量为97.1ml/L，比纤维素降解率达到最大值的时间(30 40h)滞后，这点符合产氢细菌菌株的代谢特征的。
本实施方式中选择牛粪堆肥为菌种筛选源，筛选得到菌为严格厌氧细菌， 且在降解纤维素的同时能够同步产氢。
权利要求
1、一种降解木质纤维素类生物质产氢细菌的筛选方法，其特征在于降解木质纤维素类生物质产氢细菌的筛选方法按以下步骤实现a、取10g牛粪堆肥样品放入三角瓶中，加入生理盐水和数颗玻璃珠，在摇床上振荡30min，然后取1mL上清液接种于CM3纤维素滤纸培养基中静置培养一周，得菌体富集液；b、取1mL菌体富集液用厌氧的无菌水进行倍比稀释，再接种于CM3纤维素粉末固体培养基中，制成滚管，分离培养5～7天，然后挑取水解透明圈菌落转接于CM3纤维素滤纸培养基中纯化培养3～4天，得纯菌株；c、纯菌株接种于CM3纤维素粉末固体培养基中，制成滚管，分离培养5～7天，然后挑取水解透明圈菌落转接于CM3纤维素滤纸培养基中纯化培养3～4天，再转接于CM3纤维二糖固体培养基中培养至得到单一菌落；d、将单一菌落接种于CM3纤维素粉末液体培养基中，在37℃、130r/min的条件下振荡培养一周后检测气相，有氢气产生的即为降解木质纤维素类生物质产氢细菌；其中步骤a中生理盐水为充入无菌氮气的生理盐水；步骤a中CM3纤维素滤纸培养基是在改良CM3培养基中加入滤纸条；步骤b中CM3纤维素粉固体培养基是在改良CM3琼脂培养基中加入纤维素粉；步骤c中CM3纤维二糖固体培养基是在改良CM3琼脂培养基中加入纤维二糖；步骤d中CM3纤维素粉液体培养基是在改良CM3培养基中加入pH-101纤维素粉。
2、 根据权利要求1所述的一种降解木质纤维素类生物质产氢细菌的筛选方法，其特征在于步骤a中的改良CM3培养基每1000mL由L5g的KH2P04、4.2g的Na2HP04'12H20、 0.5g的NH4C1、 0.18g的MgCl2*6H20、 2.0g的酵母浸粉、0.5g的还原剂L-半胱氨酸、2.00mL质量浓度为0.1%的氧化还原电位指示剂、lOmL的微量元素液和余量的水组成，pH值为6.8 7.2;所述的微量元素液每1000mL由O.Olg的维生素B12、 0.025g的抗坏血酸、0.025g的核黄素、0.02g的柠檬酸、0.05g的吡多辛、O.Olg的叶酸、O.Olg的对氨基苯甲酸、0.025g的肌酸、O.Olg的MnS04*7H20、 0.05g的ZnS04'7H20、 O.Olg的113:803、 O.Olg的N(CH2COOH)3、O.Olg的CaCl2*2H20、O.Olg的Na2MoO4、0.2g的CoCl2'6H20、O.Olg的A1K(S04)2和余量的水组成。
3、 根据权利要求2所述的一种降解木质纤维素类生物质产氢细菌的筛选方法，其特征在于步骤a中滤纸条为经过处理的滤纸裁剪而成，即采用质量浓度为1%的醋酸浸泡滤纸条24h，然后用碘液检查确定无淀粉后，再用质量 浓度为2%的苏打水冲洗滤纸条至中性，晾干后裁剪。
4、根据权利要求3所述的一种降解木质纤维素类生物质产氢细菌的筛选 方法，其特征在于步骤b中的改良CM3琼脂培养基是在改良CM3培养基中 加入琼脂。
全文摘要
一种降解木质纤维素类生物质产氢细菌的筛选方法，它涉及一种产氢细菌的筛选方法。它解决了现在有机废水中筛选得到的产氢菌不适合降解木质纤维素产氢工艺，而且以牛粪堆肥作为天然混合产氢菌来源制备氢气的方法存在产生的气体中杂质多、氢气量少、工艺难以控制的问题。方法a.菌体富集；b.菌体富集液倍比稀释后进行分离纯化；c.继续分离纯化至得到单一菌落；d.培养单一菌落，检测气相，有氢气产生的即为降解木质纤维素类生物质产氢细菌。本发明得到的菌株在发酵中能够产生氢气，产氢量大、气体中杂质少、产氢工艺容易控制。本发明方法得到的菌株对纤维素的针对性强，在降解纤维素的同时能够同步产氢，适合应用在降解木质纤维素产氢工艺。
文档编号C12N1/22GK101492652SQ20091007145
公开日2009年7月29日 申请日期2009年2月27日 优先权日2009年2月27日
发明者任南琪, 充 刘, 曹广丽, 王爱杰, 许继飞, 高灵芳 申请人:哈尔滨工业大学