专利名称：：人干扰素α-2b与人胸腺素α1的融合蛋白及其制备的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种人干扰素a_2b和人胸腺素a1的融合蛋白工程菌的构建以及融合蛋白的制备。
背景技术：
：干扰素(IFN)是一种广谱抗病毒剂，具有抗病毒、抗增殖和免疫调节的功能。它并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。临床上用于治疗病毒性疾病、肿瘤和多发性硬皮病等。人干扰素a有166或165个氨基酸组成，分子量为19000Da左右，目前已经克隆并确定氨基酸序列的人干扰素a亚成员有20种以上。干扰素具有很大的临床应用价值，对它的研究开发非常的深入。胸腺素a1(thymosinalphal，Ta1)是从胸腺素组分5(TF5)中分离纯化出的，由28个氨基酸残基组成的酸性多肽，不含甲硫氨酸、半胱氨酸和芳香族氨基酸，其Mr为3108Da，pI4.2，N端被乙酰化，但其对活性影响不显著。在各种抗原或致有丝分裂原激活后，Ta1能够增加T细胞IFN，IL-2和IL-3等淋巴因子的分泌，增加T细胞表面淋巴因子受体的水平；Ta1还能影响NK前体细胞的募集，使其在暴露于淋巴因子后变得更有细胞毒性；在活体内Ta1能增加ConA激活后的小鼠淋巴细胞增加分泌IL-2并增加IL-2受体的表达作用；配伍其他细胞因子具有抗肿瘤作用。Ta1临床用途广泛，已应用于治疗乙肝、丙肝、癌症及免疫缺陷等疾病的研究中，是一种针对T淋巴细胞的免疫增强剂。Ta1有巨大的医学价值，可治疗一些免疫系统受抑制或破坏的疾病，包括慢性乙肝、丙型肝炎、爱滋病、癌症等。目前国外化学合成的Ta1已临床应用，但成本高，价格昂贵。Tal作为一种免疫增强剂，临床用途广泛。目前市场出售的Ta1均为全人工合成，成本高、污染环境。而组织提取又受到材料来源的限制，且产量极低。人干扰素a-2b和胸腺素a1联合应用人干扰素a-2b和胸腺素a1的生物活性相辅相成，干扰素具有良好的抗病毒作用，是目前治疗慢性乙型肝炎较为有效的药物，但近期疗效仅为50%左右，且复发率较高；胸腺素a1可以促进T细胞及自然杀伤细胞的分化与成熟，并可促进病毒感染细胞表达病毒抗原，有利于HBV感染清除。所以干扰素与胸腺素a1的抗病毒作用在理论上有一定的互补性。经研究发现，二者联合应用已广泛证明对肝炎和肿瘤的治疗作用明显强于两者的单独使用。虽然已证明人干扰素a-2b和胸腺素a1联合应用能大大提高包括慢性肝炎、肿瘤等疾病的治疗效果，但是由于这两种药品要分别生产，用药成本非常高。另一方面，在治疗过程中需分别注射这两种药物，不但延长了治疗周期，而且大大增加了患者的痛苦。由于这些原因，迫切需要开发一种能够兼容人干扰素a-2b和胸腺素a1生物活性的药物。美国专利US6319691公开了一种胸腺素α1和人干扰素α-2b的融合蛋白，在两个蛋白之间增加了一段连接肽，它既具有干扰素α的抗病毒活性，又具有胸腺素α1的免疫学活性，同时将生产两种药物的工艺简化为一个工艺。此专利只是利用本领域人员熟知的方法使用连接肽把两种蛋白质连接起来，并没有研究干扰素的结构与连接的关系。另外，2003年9月中国专利03156231.0公开了一种胸腺素α1和人复和干扰素的融合蛋白，同样在两个蛋白之间加上了一段连接肽，同样具有二者的活性。本发明通过分析干扰素的结构，胸腺素α连在人干扰素a_2b的C端不需要连接肽，根据大肠杆菌、酵母、CHO细胞等表达系统的密码子偏嗜性特点，人工合成IFNa-2b-Ta1融合蛋白的多个基因，使其能够在大肠杆菌、酵母、CHO细胞中高效表达。在大肠杆菌体内表达融合蛋白，大肠杆菌易于培养、扩增迅速、周期短、表达产物纯化简单、成本较低等优点，所获得的融合蛋白其干扰素比活性仍然在lX108IU/mg。利用本领域人员熟知的技术，本发明的融合蛋白不局限于以大肠杆菌为宿主的表达。我们把胸腺素α1连在人干扰素α~2b的N端不使用连接肽，人工合成TαI-IFNα-2b融合蛋白基因，同样使其在大肠杆菌里表达，表现为不能稳定的表达。分析原因是由于干扰素的第一氨基酸是半胱氨酸，如果直接连接到胸腺素α1后，会影响干扰素的正常折叠，从而影响其稳定表达。根据上述试验的结果，为了能够使干扰素稳定表达，我们在胸腺素与干扰素之间加上了一段包括5个氨基酸的连接肽，同时为了进一步增强融合蛋白的免疫活性，设计了双体胸腺素。最终人工合成了TαI-M-IFNα_2b_Tα1融合蛋白基因，同样使其在大肠杆菌里稳定高效表达。所获得的融合蛋白其干扰素比活性在0.9Χ108IU/mg以上。本发明的内容本发明提供了两种不同形式的具有抗病毒和增强机体免疫力功能的融合蛋白，以及融合蛋白的制备。本发明的融合蛋白IFNα_2b_Tα1(IT)，由人干扰素α_2b和胸腺素α1两大功能区构成，中间无任何连接肽形式，具有双重功能，其干扰素比活性仍然在lX108IU/mg。本发明的融合蛋白TαI-M-IFNα_2b_Tα1(TIT)，由人干扰素α-2b和双体胸腺素α1三大功能区构成，且在Tα1与IFNα-2b之间加入了一段含有0_8个氨基酸残基的连接肽，优选为4-5个氨基酸残基的连接肽，连接肽中以甘氨酸为主，例如连接肽可以为GXXXG，三个X中任意2个X是甘氨酸，另一个可以为丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸，其中之一是GGSGG.。此连接形式可以保证干扰素的功能和蛋白表达的稳定性，另一方面，由于使用双体胸腺素而使得机体免疫能力更强，其干扰素比活性在0.9X108IU/mg以上。本发明的融合蛋白是利用基因重组技术制造的。本发明的融合蛋白根据氨基酸序列，利用氨基酸密码子的简并性特点，依据不同表达宿主，包括大肠杆菌、酵母、CHO细胞等多种表达宿主的密码子偏嗜性，本领域人员可以编码不同的核苷酸序列，使其在不同宿主内高效表达。本发明所设计的核苷酸序列可以化学合成，也可以采用PCR方法获得。选择在大肠杆菌内高效表达的pET系列表达载体，在酵母里表达的pPIC9k表达载体、在CHO细胞内表达的pcDNA3.1表达载体。在大肠杆菌内pET3a+最适合该融合蛋白的表达、且纯化方法也比较简单，不会存在标签难以去除的问题。将其构建到表达载体pET3a+上，使其在大肠杆菌内高效表达。其存在形式为包涵体，制备方法为培养工程菌，离心收集菌体，破菌，收集包涵体，包涵体经洗涤、变性、复性后，分别使用阳离子层析介质和阴离子层析介质进行纯化，获得纯度为95%以上的样品。将所获得的纯度较高的融合蛋白，分别与干扰素(市售)和化学合成的胸腺素进行肿瘤抑制实验。在实验过程中采用的方法是取接种有H22肿瘤细胞的小鼠，分别注射不同浓度的融合蛋白(IT)、干扰素(市售)、化学合成的胸腺素，连续给药16d，停药后两小时杀鼠，观察肿瘤生长情况。结果表明，本发明的融合蛋白较干扰素(市售)和化学合成的胸腺素相比有明显的抗肿瘤作用，肿瘤抑制率可达到40%以上，且能明显的刺激小鼠胸腺的生长，增强小鼠的免疫力。本发明以IT融合蛋白为例，以附图的形式进行说明，但以下说明并不构成对本专利的限制。图1为表达质粒pET-IT的载体构建图图2为表达质粒pET-IT的双酶切图谱图3为pET-IT融合蛋白的SDS-PAGE电泳图4为CM柱纯化后pET-IT的融合蛋白的SDS-PAGE电泳图5为Q柱纯化后pET-IT的融合蛋白的SDS-PAGE电泳具体实施例方式以下通过实施例详细说明本发明的内容，但这些实施例并不构成对本发明的限制。下面以大肠杆菌为宿主菌具体叙述一下该融合蛋白的构建与制备过程。实施例1工程菌构建方法融合基因片段的人工合成根据大肠杆菌密码子使用频率表，选择在大肠杆菌中高效表达的密码子，人为设计TαI-M-IFNα_2b_Tα1(Μ序列为GGSGG)和IFNα_2b_Tα1融和蛋白基因的序列，委托上海生工生物工程有限公司合成。现以IFNα-2b-TαI(IT)为例详细叙述其构建和制备过程。融合蛋白表达质粒的构建IFNα_2b_Tα1融合基因表达质粒的构建取IFNα_2b_Tα1融合基因的质粒，使用NdeI和BamHI进行双酶切回收小片段，同时取pET-3a+原核表达载体，使用NdeI和BamHI进行双酶切回收大片段，将回收的两个片段利用T4连接酶连接，转化进大肠杆菌DH5α中，筛选阳性重组子。经双酶切鉴定和序列测序分析确定后将其命名为PET-IT.pET-IT表达工程菌的构建将pET-IT的表达质粒分别转化进表达菌株BL21(DE3)中，挑取若干菌落，经LB过夜培养，次日提取质粒，经NdeI和BamHI酶切鉴定后，选择若干阳性克隆经LB过夜培养，次日以10%的浓度转接至新的LB培养基中，培养2-4个小时，监测OD值达到0.4-0.6时开始使用lmol/LIPTG诱导表达2到4小时，收集菌体，表达产物经SDS-PAGE分析，筛选高表达的菌株，扫描分析发现表达量均在30%左右，且表达产物大部分为包涵体.实施例2融合蛋白的制备对筛选出的高表达菌株进行大规模的诱导表达，收集菌体后使用破菌液(50mMTris、lmMgS04、50yg/ml溶菌酶)悬浮菌体，室温搅拌30min，现象为细胞破碎，核酸释放，菌液粘稠，然后使用超声细胞破碎仪冰浴破碎，离心后获得一定量的包涵体，观察包涵体的状态。使用包涵体的洗涤液(0.3%TritonX_100、20mMTris_HCl、5mMEDTA，pH8.0)对其进行2-3次的洗涤、确保清洗干净，离心后收集包涵体，使用(30mMTris-HCl、20mMDTT,6Μ盐酸胍或8Μ尿素)抽提液以120的体积进行变性抽提，离心后取上清，使用(30mMTris-HCl,0.5mMGSSG)的复性液以180的体积进行稀释复性。然后将所得复性液进行超滤浓缩，调pH至4.5，使得大部分的菌体蛋白沉淀，离心后收集上清，在PH4.5条件下，使用20mMNaAC-HAC的平衡液平衡CMSepharoseFF,上样后再次平衡，然后使用O-IMNaCl、20mMNaAC-HAC的洗脱缓冲液梯度洗脱，进行初步的纯化。随后将所获得的纯化产物的PH调节到8.0，使用20mMTris-HClpH8.0的平衡液平衡QSepharoseFF,上样后再次平衡，再使用O-IMNaCl、30mMTris-HClpH8.0的洗脱缓冲液进行梯度洗脱，使其进一步的纯化浓缩。电泳检测获得的融和蛋白纯度可达到95%以上。实施例3融合蛋白的抗肿瘤试验取4只小鼠腹腔注射H22瘤株，1周处死所有小鼠，取腹水。取60只小鼠，腋下注射腹水0.2ml，细胞浓度为IX107ml。接种后4h开始给药。将腋下注射小鼠随机分为6组，胸腺素组(皮下注射胸腺素4yg/只，0.2ml)；干扰素组(皮下注射干扰素3XIO5U/只，0.2ml)；IT高剂量组(皮下注射IT9XIO5U/只，0.2ml)；IT中剂量组(皮下注射IT3XIO5U/只，0.2ml)；IT低剂量组(皮下注射ITIXIO5U/只，0.2ml)；对照组(皮下注射等体积生理盐水)。连续给药16d。结果停药后2h，处死所有动物，再解剖皮下瘤块称重。对照组小鼠平均瘤重为2.50g,高于lg，表明肿瘤生长良好。其中胸腺素组有1只小鼠胸腺较大；干扰素组有1只小鼠胸腺较大；IT中剂量组有3只小鼠胸腺较大；IT高剂量组有4只小鼠胸腺较大。称取取下的肿瘤，计算抑瘤率<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实验结果表明所构建的IT融合蛋白具有明显的刺激胸腺增生、抑制肿瘤生长的作用。权利要求一种融合蛋白，其特征在于具有人干扰素α-2b功能的多肽和具有入胸腺素α1功能的多肽融合，其连接方式为Tα1-M-IFNα-2b-Tα1、IFNα-2b-Tα1。其中，Tα1代表人胸腺素α1，IFNα-2b代表人干扰素α-2b，M代表连接肽。2.权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于融合蛋白TaI-M-IFNa_2b_Ta1，在Ta1与IFNa_2b之间加上了一段连接肽，该连接肽的形式为0-8个氨基酸，最优化的形式是4-5个氨基酸。3.权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于融合蛋白IFNa-2b-Ta1，在IFNa_2b和Ta1之间不存在连接肽，并不影响该蛋白的表达及活性。4.权利要求2所述融合蛋白的DNA，其特征在于其氨基酸密码子可以是其简并密码子的任意一个。5.权利要求3所述融合蛋白的DNA，其特征在于其氨基酸密码子可以是其简并密码子的任意一个。6.一种表达载体，其特征在于它含有权利要求4和权利要求5所述DNA中的一种。7.权利要求6所述表达载体，是真核细胞表达载体和原核细胞表达载体，优选PET系列载体。8.一种宿主细胞，其特征在于它含有权利要求9的载体。9.权利要求8所述宿主细胞，是动物细胞、酵母、大肠杆菌，优选大肠杆菌。10.一种融合蛋白的纯化方法，其特征是包含以下的步骤在PH4.5的条件下，使用醋酸_醋酸钠缓冲液，利用阳离子层析介质在低浓度氯化钠条件下上样，高浓度氯化钠条件下洗脱纯化；然后在PH8.2的条件下，使用Tris-HCl缓冲液，利用阴离子层析介质进一步纯化，获得纯度95%以上样品。全文摘要本发明提供了人干扰素α-2b和人胸腺素α1的融合蛋白中人干扰素α-2b和人胸腺素α1之间的连接方式以及融合蛋白的制备方法。文档编号C12N1/21GK101798350SQ200910071380公开日2010年8月11日申请日期2009年2月5日优先权日2009年2月5日发明者冷国庆,刘艳,朱红杰,李会成,李郑武,王晴,赵华南,陈玉军,高晶申请人:哈药集团生物工程有限公司