一种木质纤维素的生物?离子液体联合预处理方法
【专利摘要】本发明涉及一种利用细菌和离子液体联合预处理提高木质纤维素糖化效率的方法。首先利用一株高效的木质素降解菌Sphingobacterium sp.LD?1(保藏号为CGMCC No.10920)对木质纤维素原料进行生物处理，去除部分木质素、半纤维素，并在一定程度上破坏木质纤维素致密的结构；再进一步利用离子液体在一定温度下对木质纤维素预处理一定时间。本发明能减少木质素、半纤维素组分所占比例，明显降低木质纤维素的结晶度，增大纤维素酶的可及表面，提高木质纤维素的糖化效率。本发明具有对设备抗压和抗腐蚀性要求不高、操作简单、环境友好等优点。CGMCC NO. 1092020150528
【专利说明】
一种木质纤维素的生物-离子液体联合预处理方法
技术领域
[0001]本发明属于木质纤维素原料预处理技术领域，具体来讲是一种细菌Sphingobacterium sp.LD-1与离子液体联合预处理木质纤维素原料提高酶解效率的方法。
【背景技术】
[0002]随着全球经济、文化的不断发展，人们对于可再生能源的需求越来越大，而木质纤维素是地球上最丰富的天然可再生生物质资源。近年来，利用木质纤维素制取燃料乙醇受到了国内外专家学者的广泛关注，发展木质纤维素生产燃料乙醇的能源技术，对于解决当今能源短缺、环境污染、粮食危机等都有十分重大的意义。
[0003]木质纤维素构成了植物的细胞壁，它主要由纤维素、半纤维素和木质素三部分组成。纤维素是由D-葡萄糖通过β_1，4糖苷键联结而成的线性高分子聚合物，由结晶相和非结晶相交错形成，结晶相结构致密，阻碍纤维素的分解。半纤维素是由几种不同类型五碳糖和六碳糖构成的异质多聚体，它结合在纤维素微纤维的表面，并且相互连接。木质素是由苯丙烷及其衍生物为基本组成单位而形成的高分子芳香族化合物，主要作用是通过形成交织网来硬化细胞壁，为次生壁主要成分，在水解纤维素过程中扮演着屏障作用。预处理过程的目的就是破坏木质素、半纤维素对纤维素的包裹，降低木质纤维素结晶度，增大酶的可及表面，提高酶解效率。
[0004]离子液体是指在室温或接近室温下呈现液态的、完全由阴阳离子所组成的盐，也称为低温熔融盐。作为一种新型的绿色溶剂，离子液体有着极低的蒸气压、不易燃、热稳定性好、可设计还可循环利用，在有机合成、催化、电化学等领域有广泛的应用。2002年Rogers等人发现室温离子液体能够溶解纤维素，自此，室温离子液体在木质纤维素预处理方向引起了学术界和企业界的高度重视。大部分离子液体预处理木质纤维素都是利用离子液体对木质纤维素的溶解性在高温、低固条件下剧烈搅拌将木质纤维素溶解，再加入反溶剂使纤维素重析再生，以破坏木质纤维素结构、降低其结晶度来提高酶解糖化率。该工艺对设备的要求严苛、成本高。
[0005]生物(包括真菌、细菌、放线菌等)也广泛应用于木质纤维素产乙醇的预处理，尤其是白腐真菌。生物方法处理条件温和、不造成环境污染、成本低，但预处理时间长、效率低、糖成份有损失等缺点阻碍了其发展。
【发明内容】
[0006]为解决上述技术问题，本发明的目的在于利用一种生物联合离子液体预处理的方法提高木质纤维素的酶解糖化效率。
[0007]本发明采用如下技术方案:
[0008](I)木质纤维素干燥、粉碎，控制粒径为180μπι?425μπι;
[0009](2)将保存在LB斜面的LD-1菌体接种于LB液体培养基中，于25 °C?40 °C温度下，培养16?24h，得到LD-1的种子液；
[0010](3)其中所述LB液体培养基各成分配比为:蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1L;所述LB斜面是在上述配方的基础上加入15?20g/l的琼脂；
[0011](4)将上一步所得到的LD-1种子液在6000?12000rpm条件下离心I?5分钟，弃去上层清液，收集菌体；
[0012](5)进一步将收集的LD-1菌体按5?15% (体积比)接种量，接种于木质纤维素液体培养基中，于25°C?40°C温度下，自然pH，培养3?7天；
[0013](6)其中所述木质纤维素液体培养基各成分配比为:木质纤维素10.0g，K2HPO4I.0g，(NH4)2S042.0g^KH2PO4 I.0g,MgSO40.2g，CaCl20.Ig,FeSO40.05g,MnSO40.02g，蒸馏水1L;
[0014](7)将经过LD-1培养后的木质纤维素清洗至pH呈中性后，于50°C?60°C烘干至恒重；
[0015](8)在LD-1预处理木质纤维素与离子液体质量比为1:2?1:5的条件下将两者混合均匀，于90?130°C下静置2?6h，随后冷却至室温，加入去离子水，过滤、洗涤滤渣，干燥后获得预处理木质纤维素；
[0016](9)将预处理木质纤维素按照固液比为10?30mg/mL与柠檬酸盐缓冲液混合，再按照10?40FPU/g底物的比例加入纤维素酶，在100?200rpm/min，40?60°C条件下，酶解12?48小时。
[00?7 ] 步骤(8)中所述的离子液体为1-乙基-3甲基咪卩坐醋酸盐([Emim ] [ Ac ])。
[0018]步骤(9)中所述的柠檬酸盐缓冲液的的浓度为0.1moI/L，pH为4.8。
[0019]本发明提供的预处理方法的优势在于:
[0020](I)利用高效木质素降解菌LD-1生物处理与离子液体结合的两步法，去除大部分木质素组分，降低木质纤维素结晶度，增大纤维素酶的可及表面，提高木质纤维素的糖化效率；
[0021](2)采用高效木素降解细菌对木质纤维素进行预处理，与真菌预处理相比大大缩短了生物预处理周期并极大的保存了纤维素含量；
[0022](3)离子液体预处理过程中以高固条件进行反应，采用静置方式，无需对纤维素进行再生重析，简化了工艺过程，并极大地降低了能耗。
【附图说明】
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[0023]图1:经本发明组合预处理后木质纤维素各组分变化
[0024]图2:经本发明组合预处理后木质纤维素酶解效果分析
[0025]图3:经本发明组合预处理的木质纤维素预处理前后扫描电镜分析
【具体实施方式】
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[0026]下面通过实施例进一步说明本发明。
[0027]实施例1
[0028](I)将水稻秸杆洗净、烘干、粉碎，控制其粒径分布在180μπι?425μπι之间；
[0029](2)将保存在LB斜面的LD-1菌体接种于LB液体培养基中，于30 °C温度下，培养18h，得到LD-1的种子液；
[0030](3)其中所述LB液体培养基各成分配比为:蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1L，所述LB斜面是在上述配方的基础上加入15g/l的琼脂；
[0031 ] (4)将上一步所得到的LD-1种子液在1000rpm条件下离心2分钟，弃去上层清液，收集菌体；
[0032](5)进一步将收集的LD-1菌体按10% (体积比)接种量，接种于木质纤维素液体培养基中，于30°C温度下，自然pH，培养3天；
[0033](6)其中所述木质纤维素液体培养基各成分配比为:木质纤维素10.0g，K2HPO4I.0g，(NH4)2S042.0gjKH2PO4I.0g,MgSO40.2g，CaCl20.Ig，FeSO40.05g,MnSO40.02g，蒸馏水1L;
[0034](7)将经过LD-1培养后的木质纤维素清洗至pH呈中性后，于55°C烘干至恒重；
[0035](8)在LD-1预处理木质纤维素与[Emim] [Ac]质量比为1:3的条件下将两者混合均匀，于130°C下静置2?6h，随后冷却至室温，加入去离子水，过滤、洗涤滤渣，干燥后获得预处理木质纤维素；
[0036](9)将预处理木质纤维素按照固液比为25mg/mL与柠檬酸盐缓冲液混合，再按照12FPU/g底物的比例加入纤维素酶，在110?150rpm/min，50 °C条件下，酶解48小时；
[0037]通过本实施例的实施，如附图1所示，经本方法处理后的水稻秸杆中木质素与半纤维素含量显著降低，纤维素比例提升;预处理后的水稻秸杆酶解48小时后还原糖收率最高达到98% (如附图2)，而未经预处理的水稻秸杆酶解后还原糖得率仅为20.7%，经该实施例预处理后，水稻秸杆酶解效率提高为原来的4.7倍;结合扫描电镜图像(如附图3)所示，未经预处理的水稻秸杆(a、b)呈直杆状且杆径较粗，表面平整光滑，而经本实施例预处理后的水稻秸杆(c、d)刚性结构已完全破坏，表面侵蚀严重，大量纤维素暴露出来。
[0038]实施例2
[0039](I)将水稻秸杆洗净、烘干、粉碎，控制其粒径分布在180μπι?425μπι之间；
[0040](2)将保存在LB斜面的LD-1菌体接种于LB液体培养基中，于30 °C温度下，培养18h，得到LD-1的种子液；
[0041](3)其中所述LB液体培养基各成分配比为:蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1L，所述LB斜面是在上述配方的基础上加入15g/l的琼脂；
[0042](4)将上一步所得到的LD-1种子液在1000rpm条件下离心2分钟，弃去上层清液，收集菌体；
[0043](5)进一步将收集的LD-1菌体按10% (体积比)接种量，接种于木质纤维素液体培养基中，于30°C温度下，自然pH，培养3天；
[0044](6)其中所述木质纤维素液体培养基各成分配比为:木质纤维素10.0g，K2HPO4I.0g，(NH4)2S042.0gjKH2PO4I.0g,MgSO40.2g，CaCl20.lg,FeSO40.05g,MnSO40.02g，蒸馏水1L;
[0045](7)将经过LD-1培养后的木质纤维素清洗至pH呈中性后，于55°C烘干至恒重；
[0046](8)在LD-1预处理木质纤维素与[Emim] [Ac]质量比为1:2?1:5的条件下将两者混合均匀，于110°C下静置4?6h，随后冷却至室温，加入去离子水，过滤、洗涤滤渣，干燥后获得预处理木质纤维素；
[0047](9)将预处理木质纤维素按照固液比为25mg/mL与柠檬酸盐缓冲液混合，再按照12FPU/g底物的比例加入纤维素酶，在110?150rpm/min，50 °C条件下，酶解48小时；
[0048]经本实施例预处理后的水稻秸杆酶解后还原糖得率最高从20.7%提升到86.9%，酶解效率提高为原来的4.1倍。
[0049]实施例3
[0050](I)将水稻秸杆洗净、烘干、粉碎，控制其粒径分布在180μπι?425μπι之间；
[0051 ] (2)将保存在LB斜面的LD-1菌体接种于LB液体培养基中，于30 °C温度下，培养18h，得到LD-1的种子液；
[0052](3)其中所述LB液体培养基各成分配比为:蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1L，所述LB斜面是在上述配方的基础上加入15g/l的琼脂；
[0053](4)将上一步所得到的LD-1种子液在1000rpm条件下离心2分钟，弃去上层清液，收集菌体；
[0054](5)进一步将收集的LD-1菌体按10% (体积比)接种量，接种于木质纤维素液体培养基中，于30°C温度下，自然pH，培养3天；
[0055](6)其中所述木质纤维素液体培养基各成分配比为:木质纤维素10.0g，K2HPO4I.0g，(NH4)2S042.0gjKH2PO4I.0g,MgSO40.2g，CaCl20.lg,FeSO40.05g,MnSO40.02g，蒸馏水1L;
[0056](7)将经过LD-1培养后的木质纤维素清洗至pH呈中性后，于55°C烘干至恒重；
[0057](8)在LD-1预处理木质纤维素与[Emim] [Ac]质量比为1:2?1:5的条件下将两者混合均匀，于130°C下静置2h，随后冷却至室温，加入去离子水，过滤、洗涤滤渣，干燥后获得预处理木质纤维素；
[0058](9)将预处理木质纤维素按照固液比为25mg/mL与柠檬酸盐缓冲液混合，再按照12FPU/g底物的比例加入纤维素酶，在110?150rpm/min，50 °C条件下，酶解48小时；
[0059]经本实施例预处理后的水稻秸杆酶解后还原糖得率最高从20.7%提升到91.08%,酶解效率提高为原来的4.4倍。
[0060]注:本专利涉及的细菌Sphingobacterium sp.1^)_1于2015年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏编号:CGMCC N0.10920，分类命名为鞘氨醇杆菌Sphingobacterium sp。
【主权项】
1.一种木质纤维的生物-离子液体联合预处理方法，其特征在于:包括以下几个步骤:(I)细菌Sphingobacteriumx).LD-1 预处理:、岛Sphingobacteriump.LD-1菌体按5?15%(体积比)接种量，接种于木质纤维素液体培养基中，于25?40°C、自然pH条件下，培养3~7天，所得木质纤维素用超纯水清洗3次，烘干至恒重； (2)离子液体预处理:将步骤(I)所得木质纤维素与[Emim] [Ac]按质量比为1: 2?1: 5混合均匀，90°0130°C恒温环境静置2?6 h后，冷却至室温，加入去离子水，过滤、洗涤滤渣，干燥后获得预处理木质纤维素。2.根据权利要求1所述的提高木质纤维素糖化效果的组合预处理方法，其特征为步骤(1)中木质纤维素经细菌uffisp.LD-1在25?40°C、自然pH条件下，培养3?7天。3.根据权利要求1所述的提高木质纤维素糖化效果的组合预处理方法，其特征为步骤(2 )中所述的离子液体为1-乙基-3甲基咪卩坐醋酸盐([Emim ] [ Ac ])。4.根据权利要求1所述的提高木质纤维素糖化效果的组合预处理方法，其特征为步骤(2)中木质纤维素与[Emim][Ac]按质量比为1:2~1:5混合均匀，90°0130°(:恒温环境静置2~.6 h
【文档编号】C12P19/14GK106086115SQ201610770559
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月30日
【发明人】陈跃辉, 周沫, 戴友芝
【申请人】湘潭大学