一种用于提高粘球菌素发酵产量的添加剂及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种用于提高粘球菌素发酵产量的添加剂，所述添加剂是油酸甲酯，其在粘球菌素液体发酵培养基中添加的终浓度为15μl/ml，添加的时间是黄色粘球菌发酵后36小时。实验证实，本发明公开的添加剂能够促进黄色粘球菌代谢产生粘球菌素，相较于未添加油酸甲酯的CYE液体发酵培养基而言，在添加了油酸甲酯后粘球菌素的发酵产量提高了7.75倍，证明本发明在粘球菌素的发酵技术方面有了显著地提升，且本发明方法降低了粘球菌素的发酵成本，预示其在发酵生产粘球菌素中具有重要的经济价值和广阔应用前景。
【专利说明】
一种用于提高粘球菌素发酵产量的添加剂及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种用于发酵生产的添加剂，尤其涉及一种用于提高粘球菌素发酵产 量的添加剂及其应用，属于抗生素药物发酵制备技术领域。
【背景技术】
[0002] 20世纪最引人注目的医学成就无疑是抗生素的发现。1928年人们发现了世界上第 一种抗生素一青霉素，开启了抗生素研究的黄金时代。人们从此掌握了对抗病原菌的有力 武器，使得曾经非常致命的细菌感染可以得到控制和治疗，无数人的生命因此得到挽救。但 是近年来随着抗生素的过度使用，出现了表型变异和基因变异的耐药细菌，甚至是出现了 一些几乎可以抵抗绝大多数抗生素药物的超级耐药细菌。在过去的几十年里，科学家们一 直致力于新型抗生素的研发，力图与耐药细菌进行赛跑。然而，最近一项研究表明，在过去 的30年里新型抗生素的研发严重滞后。自2005年以来仅有3类新型抗生素药物被批准上市 (Bassetti et al.，2013)。从寻找新的化合物到将它们设计为抗生素药物并获准临床应用 需要一个漫长的过程。在此期间，新型抗生素的研发速度一旦滞后公众健康问题将岌岌可 危。因此寻求具有较广抗菌谱的新型抗生素成为当下一项迫在眉睫的任务。
[0003]粘细菌(Myxobacteria)是具有复杂多细胞行为特征的细菌类群，被认为是高等的 原核生物。并且，粘细菌的次级代谢产物种类多、结构新、作用机制独特，是继放线菌之后又 一个重要的、有巨大应用潜力的药源微生物新类群（此;[ (;]161^3(311，2001;661'1：11，6七31·， 2003)，在新药研发中具有独特的优势。
[0004] 粘球菌素(Myxovirescin)是黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)中报道的一类28 元大环内酯内酰胺类化合物(式1)。其作用靶点是IspA基因编码的二型信号肽酶，属于二型 信号肽酶抑制剂，可以抑制细朐内含有LsnA翦切仿点的脂蛋白前体的加工（Xiao et al.， 2012)。
[0005]
[0006] 诸多文献表明，粘球菌素是一类快速杀菌剂，并且对多数革兰氏阴性菌和少数革 兰氏阳性菌均具有很好的杀菌活性(Gerth et al.，1982;0nishi et al.，1984;Content et al.，2003)。作为一类结构较为新颖的广谱抗生素，粘球菌素具有潜在的广阔应用前景。
[0007] 但是目前粘球菌素在黄色粘球菌中的产量偏低（Simunovic et al. ,2006)，在一 定程度上限制了其后续的研究与应用。因此，需要探索粘球菌素的发酵技术方面的改进，促 进粘球菌素发酵产量的提高。检索发现有关该方面的专利或文献，尤其是关于用于提高粘 球菌素发酵产量的添加剂至今无报道。
[0008] 参考文献：
[0009] Bassetti,M.,Merelli,M.,Temperoni,C.,&Astilean,A.(2013).New antibiotics for bad bugs:where are we?.Annals of clinical microbiology and antimicrobials,12(I), I.
[0010] ContentjS.,DuttonjC.J.,&Roberts,L.(2003).Myxovirescin analogues via macrocyclic ring-closing metathesis.Bioorganic&medicinal chemistry letters,13 (3),321-325.
[0011] Gerth，K. ,Irschik，H. ,Reichenbach，H.，&Trowitzsch，W.(1982).The myxovirescins,a family of antibiotics from Myxococcus virescens (Myxobacterales).The Journal of antibiotics，35(11)，1454-1459·
[0012] Gerth，K.，Pradella，S.，Perlova，0·，Beyer，S.，&Μ? I Ier，R. (2003) .Myxobacteria:proficient producers of novel natural products with various biological activities-past and future biotechnological aspects with the focus on the genus Sorangium.Journal of biotechnology，106(2)，233-253·
[0013] OnishijN.,Izaki,K.,&Takahashi,H.(1984).A macrocyclic antibiotic M-230B produced by Myxococcus xanthus.Isolation and characterization. The Journal of antibiotics，37(I)，13-19·
[0014] Reichenbach,H.(2001).Myxobacteria,producers of novel bioactive substances.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，27(3)，149-156.
[0015] Simunovic，V.，Zapp，J.，Rachid，S.，Krug，D.，Meiser，P.，&Miiller，R.(2006) .Myxovirescin A Biosynthesis is Directed by Hybrid Polyketide Synthases/ Nonribosomal Peptide Synthetase ,3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-CoA Synthases,and trans-Acting Acyltransferases·ChemBioChem，7(8)，1206-1220·
[0016] Xiao ,Y.,Gerth,K.,MulIer,R.,&ffalI,D.(2012).Myxobacterium-produced antibiotic TA(myxovirescin)inhibits type II signal peptidase.Antimicrobial agents and chemotherapy，56(4)，2014-2021·
【发明内容】
[0017] 针对现有技术的不足，本发明要解决问题是提供一种用于提高粘球菌素发酵产量 的添加剂及其应用。通过向黄色粘球菌发酵培养基中加入添加剂的方式来改善粘球菌素发 酵培养基的组分，从而实现有效提高粘球菌素的发酵产量。
[0018] 本发明所述用于提高粘球菌素发酵产量的添加剂，其特征在于:所述添加剂是油 酸甲酯，其在粘球菌素液体发酵培养基中添加的终浓度为15±UU/ml。
[0019] 其中：所述添加剂油酸甲酯优选在CYE液体发酵培养基中添加的终浓度为15μ1/ ml，添加的时间是黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)发酵后36小时。
[0020] 本发明所述用于提高粘球菌素发酵产量的添加剂在发酵生产粘球菌素中的应用。
[0021] 其中，所述发酵生产粘球菌素的方法是:将黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)在 CYE固体培养基上以pH 7.6 ± 0.1、30 ± 1°C培养4 ± 1天后转接到CYE液体发酵培养基中，在 pH 7.6 ± 0.1、培养温度30 ± 1°C、培养转速200 ± IOrpm条件下发酵36小时，然后向CYE液体 发酵培养基中添加终浓度为15μ1/πι1的油酸甲酯，继续发酵培养7±1天，获得含有粘球菌素 的发酵液；
[0022]其中，上述CYE固体培养基组成及含量为：酪蛋白胨10g，酵母浸提物5g，MgS〇4 · 7H20 lg，IOOmM MOPS溶液100ml，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml;上述CYE液体发酵培养基组成 及含量为：酪蛋白胨l〇g，酵母浸提物5g，MgS〇4· 7H20 lg，100mM MOPS溶液100ml，蒸馏水 1000ml〇
[0023] 上述应用中：所述的黄色粘球菌（Myxococcus xanthus )优选黄色粘球菌 (Myxococcus xanthus)DZE9菌株。
[0024] 上述应用中：所述黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)在CYE固体培养基上培养后 转接到CYE液体发酵培养基中的菌量以体积比计优选为1~2%。
[0025] 上述应用中：所述黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)在固体培或液体发酵培养的 pH优选为7.6，使用KOH溶液调节pH。
[0026] 具体的，本发明所述用于提高粘球菌素发酵产量的添加剂在发酵生产粘球菌素中 的应用方法是：
[0027] (1)取在_80°C条件下保存的黄色粘球菌DZE9菌株菌液20μ1，滴加到CYE固体平板 上，用事先已经在酒精灯火焰上反复灼烧并冷却至室温的接种环在CYE固体平板上进行划 线操作。
[0028] (2)将划线的CYE平板在30°C条件下倒置培养4~5天，直至有明显的黄色菌落出 现。
[0029] (3)用事先已经在酒精灯火焰上反复灼烧并冷却至室温的接种铲刮取黄色粘球菌 DZE9菌株，接种到装有50ml CYE液体培养基的300ml锥形瓶中，接种时需要用接种铲将待接 种的菌体在瓶壁上揉磨均匀，将接种的菌体打散；
[0030] (4)在30°C，200rpm的条件下振荡培养24h，至对数中前期；
[0031] (5)用CYE液体培养基调整菌体浓度至lX108Cfu/ml，按体积比2%接种量将上述 黄色粘球菌DZE9菌液转接到100ml CYE液体发酵培养基中，在30°C，200rpm的条件下振荡培 养进行发酵。
[0032] (6)培养36小时后，添加油酸甲酯(终浓度15μ1/πι1);同时按照发酵体积的1%在每 组发酵培养基中加入事先已经高温灭菌的树脂。在30°C，200rpm的条件下振荡培养，继续发 酵7天。以不添加油酸甲酯的CYE培养基作为对照组。每组实验设置4个平行。
[0033] (7)用80目筛网过滤收集树脂于IOml离心管中，用无菌去离子水冲洗树脂，洗去表 面残留的菌体。加入3ml甲醇过夜浸提。
[0034] (8)回收的浸提液用0.22μπι有机滤膜进行过滤，转移至HPLC样品瓶中。
[0035] (9)发酵液中粘球菌素的含量采用HPLC进行检测，色谱柱为XTerra MS C18column (5μηι，；125Α，2.1 X 100mm，Waters，US)，检测条件如下:进样量20μ1;流动相流速:0.3mL/min; 流动相A为含O. I %甲酸的水溶液，流动相B为含O. I %甲酸的乙腈溶液，采用多阶梯度洗脱 的方法，即〇-2min流动相B浓度为5 % ; 2-10min流动相B浓度由5 %上升到50 % ; 10-27min流 动相扮农度由50%上升到95%;27-4〇11^11流动相8的浓度维持在95%，检测波长为23911111。 [0036] (10)根据吸收峰面积与粘球菌素的关系曲线计算粘球菌素的产量，实验结果取平 均值并计算误差。
[0037] 数据显示，在不添加油酸甲酯的情况下，发酵液中粘球菌素的含量为10.3 土 3.7mg/L。当向CYE液体培养基中添加了油酸甲酯后，发酵液中粘球菌素的含量为90.2 土 18. lmg/L。提高了7.75倍。该数据表明：与不加添加剂的液体发酵培养基相比，使用含有本 发明所述添加剂的液体发酵培养基可以明显提高粘球菌素的发酵产量。
[0038] 本发明公开了一种用于提高粘球菌素发酵产量的添加剂油酸甲酯，其在粘球菌素 液体发酵培养基中添加的终浓度优选为15μ1/πι1，添加时间优选为发酵36小时。实验证实， 本发明公开的添加剂能够促进黄色粘球菌代谢产生粘球菌素，相较于未添加油酸甲酯的 CYE液体发酵培养基而言，在添加了油酸甲酯后粘球菌素的发酵产量提高了 7.75倍，证明本 发明在粘球菌素的发酵技术方面有了显著地提升，且本发明方法降低了粘球菌素的发酵成 本，预示其在发酵生产作为一类结构较为新颖的广谱抗生素粘球菌素中具有重要的经济价 值和广阔应用前景。
【附图说明】
[0039]图1.使用HPLC检测黄色粘球菌发酵液中的粘球菌素。
[0040]图2.粘球菌素紫外特征吸收峰图。
[0041] 图3.粘球菌素质谱图。
【具体实施方式】
[0042] 下面结合实施例公开的用于提高粘球菌素发酵产量的添加剂，进一步描述其在用 于提高粘球菌素发酵产量中的应用。所述内容是对本发明的解释而不是限定。
[0043] 实施例1:
[0044] (1)取黄色粘球菌DZE9菌株的菌液20μ1，滴加到CYE固体(酪蛋白胨IOg，酵母浸提 物5g，MgS〇4· 7H20 lg，100mM M0PS(3-(N-吗啉）丙磺酸）溶液 100ml，琼脂粉 15g，蒸馏水 1000ml，pH 7.6)平板上，用无菌的接种环在CYE固体平板上进行划线。
[0045] (2)将接有黄色粘球菌DZE9菌株的CYE固体平板在30°C条件下倒置培养4~5天，直 至有明显的黄色菌落出现。
[0046] (3)用无菌的接种铲刮取黄色粘球菌DZE9菌株，接种到装有50ml CYE液体培养基 ((酪蛋白胨l〇g，酵母浸提物5g，MgS〇4· 7H20 lg，100mM M0PS(3-(N-吗啉）丙磺酸）溶液 100ml，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，pH 7.6))的锥形瓶中。
[0047] (4)在30°C，200rpm的条件下振荡培养24h，至对数中前期。
[0048] (5)用CYE液体培养基调整菌体浓度至I X 108cfu/ml，按体积比2%接种量将上述 黄色粘球菌DZE9菌液转接到100ml CYE液体发酵培养基中，在30°C，200rpm的条件下振荡培 养进行发酵。
[0049] (6)培养36小时后，分别向液体发酵培养基中添加不同浓度的油酸甲酯(终浓度分 别为0、5、10、15、2(^1/!111);同时按照发酵体积的1%在每组发酵培养基中加入事先已经高 温灭菌的树脂。在30°C，200rpm的条件下振荡培养，继续发酵7天。不添加油酸甲酯的CYE培 养基作为对照组。每组实验设置4个平行。
[0050] (7)用80目筛网过滤收集树脂于IOml离心管中，用无菌去离子水冲洗树脂，洗去表 面残留的菌体。加入3ml甲醇过夜浸提。
[0051] (8)回收的浸提液用0.22μπι有机滤膜进行过滤，转移至HPLC样品瓶中。
[0052] (9)发酵液中粘球菌素的含量采用HPLC进行检测，色谱柱为XTerra MS C18column (5μηι，125Α,2· I X 100mm，Waters，US)，检测条件如下:进样量20μ1;流动相流速:0.3mL/min; 流动相A为含0.1 %甲酸的水溶液，流动相B为含0.1 %甲酸的乙腈溶液，采用多阶梯度洗脱 的方法，即〇-2min流动相B浓度为5 % ; 2-10min流动相B浓度由5 %上升到50 % ; 10-27min流 动相扮农度由50%上升到95%;27-4〇11^11流动相8的浓度维持在95%，检测波长为23911111。 [0053] (10)根据吸收峰面积与粘球菌素的关系曲线计算粘球菌素的产量，实验结果取平 均值并计算误差。实验结果如表1所示。
[0054]表1不同浓度油酸甲酯对粘球菌素发酵产量的影响。
luum」 从衣1甲的数聒我彳丨例以有出：仕个添刀p油酸中_的情/兄卜，友醉淞甲粕坏囷累的 含量为10.3 ± 3.7mg/L。当向CYE液体培养基中添加了油酸甲酯后，粘球菌素的发酵产量得 到了不同程度的提高。当油酸甲酯的终浓度达到15μ1/πι1时，发酵液中的粘球菌素发酵产量 达到最高，即90.2 ± 18. lmg/L，提高了7.75倍。但是，当油酸甲酯的终浓度进一步提高到20μ Vml时，粘球菌素的发酵产量有所下降，相比于终浓度为15μ1/πι1时下降了 12.5%，但仍然 比不添加油酸甲酯情况下要高。
[0057] 实施例2:
[0058] (1)取黄色粘球菌DZE9菌株的菌液20μ1，滴加到CYE固体(酪蛋白胨IOg，酵母浸提 物5g，MgS〇4· 7H20 lg，100mM M0PS(3-(N-吗啉）丙磺酸）溶液 100ml，琼脂粉 15g，蒸馏水 1000ml，pH 7.6)平板上，用无菌的接种环在CYE固体平板上进行划线。
[0059] (2)将接有黄色粘球菌DZE9菌株的CYE固体平板在30°C条件下倒置培养4~5天，直 至有明显的黄色菌落出现。
[0060] (3)用无菌的接种铲刮取黄色粘球菌DZE9菌株，接种到装有50ml CYE液体培养基 ((酪蛋白胨l〇g，酵母浸提物5g，MgS〇4· 7H20 lg，100mM M0PS(3-(N-吗啉）丙磺酸）溶液 100ml，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml，pH 7.6))的锥形瓶中。
[00611 (4)在30°C，200rpm的条件下振荡培养24h，至对数中前期。
[0062] (5)用CYE液体培养基调整菌体浓度至IX 108cfu/ml，按体积比2%接种量将上述 黄色粘球菌DZE9菌液分别转接到100ml CYE液体发酵培养基中，按发酵体积1 %计算在每组 发酵培养基中加入事先已经高温灭菌的树脂。
[0063] (6)分别选取发酵0小时、24小时、36小时和48小时的时候向液体发酵培养基中添 加终浓度为15μ1/πι1的油酸甲酯，在30°C，200rpm的条件下振荡培养连续发酵7天，每组实验 设立4个平行。
[0064] (7)用80目筛网过滤收集树脂于IOml离心管中，用无菌去离子水冲洗树脂，洗去表 面残留的菌体。加入3ml甲醇过夜浸提。
[0065] (8)回收的浸提液用0.22μπι有机滤膜进行过滤，转移至HPLC样品瓶中。
[0066] (9)发酵液中粘球菌素的含量采用HPLC进行检测，色谱柱为XTerra MS C18column (5μηι，125A.2.1 X 100mm，Waters，US)，检测条件如下:进样量20μ1;流动相流速:0· 3mL/min; 流动相A为含0.1 %甲酸的水溶液，流动相B为含0.1 %甲酸的乙腈溶液，采用多阶梯度洗脱 的方法，即〇-2min流动相B浓度为5 % ; 2-10min流动相B浓度由5 %上升到50 % ; 10-27min流 动相扮农度由50%上升到95%;27-4〇11^11流动相8的浓度维持在95%，检测波长为23911111。
[0067] (10)根据吸收峰面积与粘球菌素的关系曲线计算粘球菌素的产量，实验结果取平 均值并计算误差。实验结果如表2所示。
[0068]表2粘球菌素发酵产量对比。
LUU/U」 从衣2我彳丨」口」以有出，仕个冋友醉的?曰J里添刀P终浓度艿lbyl/ml油酸中_ 口」以个冋 程度的提高粘球菌素。尤其是在发酵时间为36小时的时候添加油酸甲酯，发酵液中粘球菌 素的产量最高，达到了 60.4±11.9mg/L。
【主权项】
1. 一种用于提高粘球菌素发酵产量的添加剂，其特征在于:所述添加剂是油酸甲酯，其 在粘球菌素液体发酵培养基中添加的终浓度为15±1μ1/πι1。2. 根据权利要求1所述的用于提高粘球菌素发酵产量的添加剂，其特征在于:所述添加 剂油酸甲酯在CYE液体发酵培养基中添加的终浓度为15yl/ml，添加的时间是黄色粘球菌 (Myxococcus xanthus)发酵后36小时。3. 权利要求1或2所述用于提高粘球菌素发酵产量的添加剂在发酵生产粘球菌素中的 应用。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述发酵生产粘球菌素的方法是将黄色粘 球菌(Myxococcus xanthus)在CYE固体培养基上以pH 7.6±0.1、30±1°C培养4±1天后转 接到CYE液体发酵培养基中，在pH 7.6 ± 0.1、培养温度30 ± 1°C、培养转速200 ± lOrpm条件 下发酵36小时，然后向CYE液体发酵培养基中添加终浓度为15μ1/πι1的油酸甲酯，继续发酵 培养7 ± 1天，获得含有粘球菌素的发酵液； 其中，所述CYE固体培养基组成及含量为:酪蛋白胨10g，酵母浸提物5g，MgS〇4 · 7H201g， 100mM MOPS溶液100ml，琼脂粉15g，蒸馏水1000ml;所述CYE液体发酵培养基组成及含量为： 酪蛋白胨l〇g，酵母浸提物5g，MgS〇4· 7H20 lg，100mM MOPS溶液100ml，蒸馏水1000ml。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述的黄色粘球菌(Myxococcus xanthus) 选黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)DZE9菌株。6. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于:黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)在CYE 固体培养基上培养后转接到CYE液体发酵培养基中的菌量以体积比计为1~2%。7. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于:所述黄色粘球菌(Myxococcus xanthus)在 固体培或液体发酵培养的pH为7.6，使用K0H溶液调节pH。
【文档编号】C12P17/14GK106086104SQ201610410973
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月8日 公开号201610410973.1, CN 106086104 A, CN 106086104A, CN 201610410973, CN-A-106086104, CN106086104 A, CN106086104A, CN201610410973, CN201610410973.1
【发明人】胡玮, 李越中, 王川东, 冯婉婉
【申请人】山东大学