专利名称：一种微生态制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域，更具体地指涉及一种益生素饲料添加剂。它能够在数量或种类上补充动物肠道内减少或缺乏的有益微生物，调整或维持肠道内的微生态平衡，增强机体免疫机能和抗应激能力，提高养殖效益。
背景技术：
通常单一微生物经发酵产生微生物代谢物，利用该代谢物产物作为抗菌治病，饲料添加等等的有用物质，例如中国专利CN 200410077706.4，该发明通过微生物发酵，添加剂添加到饲料中或配制非抗生素类饲料，能显著提高动物免疫能力，促进动物的新陈代谢，提高动物机体的抗病能力，改善动物的消化机能，促进动物生长，并明显改善动物的肉质。在微生物制剂的应用及发展趋势，该文综述了微生态制剂—益生素是种天然的生物活性制剂，无毒副作用，无耐药性，无药物残留物，具有保健、促进生长、提高饲料利用率等功效(出处山东家禽2001，(5)31-32页)。美国专利涉及一种检测动物饲料中微生态制剂质量标准的方法。该饲料中含有微生态菌与寡糖，检测方法主要为杂交与聚合酶链式反应技术(TIMethods for detecting and quantifying specificprobiotic microorganisms in animal feed.Inventoramer BE.Application numberS2004000711155 Patent numberS20050048515)。
发明内容
本发明的目的是提供一种采用混合菌培养具有微生物活菌制剂和酶制剂双重功效的微生态制剂，用以克服目前国内市场上益生素生产普遍存在的品种、功效单一、稳定性差的问题。
对于微生态制剂来讲，要保证益生菌正常效力的发挥，就应保证活菌制剂中活菌的含量和稳定性，使其可以经受外界因素的影响。这种新型的复合微生物菌剂参照国际研究主流方向，将单一菌株的益生菌转化为复合菌剂，因此具有多种功效，它不仅仅可以调节机体的微生态平衡，促进肠道的吸收，而且该制剂中的微生物还能分泌多种维生素和氨基酸等有益的营养成分，改善机体机能，并且产生有机酸类抗生素，杀死病原菌，防病治病。其产生的氨基酸氧化酶和分制硫化物的酶类，可分解氨、硫化氢、吲哚等有害物质，降低鸡舍内有害气体的含量，减少臭味，改善环境，减少鸡群的发病率。
另外，本发明微生态制剂的生产，采用了先进的微胶囊包埋技术，使其中的微生物可以经受温度、湿度、酸度等外界条件的影响，保证了大多数益生菌生产较难解决的稳定性问题。
本发明成品是将从动物体内分离的有益微生物，经特殊工艺发酵培殖制成的，只含活菌或包含菌体及其代谢产物的活菌制剂，乳酸杆菌、芽孢杆菌、酵母菌、丝状真菌和光合菌的一种或一种以上菌组成的。工艺流程是菌种筛选→菌种培植→原料→液体发酵→后处理→成品1.菌种筛选在选择生产菌株时，、除了使用传统的发酵菌株外，筛选所应用其他菌种必须符合以下条件①能够很好地同化基质碳源和无机氮源；②繁殖速度快，菌体蛋白含量高；③无毒性和致病性；④菌种性能稳定；⑤最好能进行混菌培养。
2.菌种培殖采用多菌种混菌培养要求菌株间存在同住或偏利生或共生关系，我们采用优良的细菌通过固体发酵粗淀粉原料及渣柏类原料。
3.原料根据菌种的生长要求，从国内十几种主要农副产品中经发酵比较培养基由黄豆粉、玉米、米糠、豆粕为主原料加上少量辅剂及微量元素组成。
4.发酵及处理在生产工艺方面，为保证产品质量，采用液体发酵工艺，从而提高生产的可控性和生产规模，降低生产成本。本微生态制剂的制备技术由丝状真菌，酵母菌，芽孢杆菌，乳酸菌，光合菌等组成。前四种菌分别在28-32℃温度环境下，固体或液体发酵40-50小时；其中乳酸菌按1∶1加入填充料；在35-50℃环境中烘干，粉碎，经40-60目过筛；光合菌在见光20℃环境下进行；加入矿物质和维生素、混合均匀制成。
5.成品分类要求表1产品技术指标
表2成品无害化指标
有益效果禾维益生素是一种功能强大的微生物菌群，养殖场使用它后，可使养殖场臭味大幅减少或消失，饲料利用率大幅度提高，家禽产蛋量增加，动物的抗病力增强、繁殖率提高，能够代替以促生长、预疾病为目的药物添加剂、酶制剂等，从而生产无药物残留的绿色饲料和降低饲料的制作成本。且生产出的动物产品为绿色食品。
禾维益生素其具有微生物活菌制剂和酶制剂的双重功效；(1)调节肠道菌系平衡有益菌进入肠道内大量繁殖，拮抗有害菌，最终定植在肠壁上形成菌系平衡，抑制有害菌侵入，同时产生大量有助于消化、促进生长的物质。
(2)消化酶的作用制剂中各类消化酶及有益菌在代谢活动中产生的各类消化酶含量达到或超过普通饲用复合酶的外源添加水平。因此，饲料得到充分消化吸收。
一、试验证明，在肉鸡日粮中加入100mg/kg禾维益生素，可使增重率提高5％-9％；在蛋鸡日粮中加入100mg/kg益生素，蛋鸡的产蛋量可提高5％；用于防治雏鸡白痢，发病率明显低于27.5％。30日龄的雏鸡平均日增重提高12.26％，蛋鸡所产的鸡蛋其蛋白质质量明显提高，蛋黄的胆固醇含量明显降低。
二、禾维益生素中的微生物能合成B族维生素、赖氨酸、蛋氨酸等营养物质，同时，还可产生蛋白酶、淀粉酶、植酸酶等多种消化酶来促进饲料的消化，从而提高蛋鸡的产蛋率和饲料报酬。
三、禾维益生素还可以产生有机酸类抗生素，杀死病原菌，起到防病治病的作用。其产生的氨基酸氧化酶和分制硫化物的酶类，可分解氨、硫化氢、吲哚等有害物质，降低鸡舍内有害气体的含量，减少臭味，改善环境，减少鸡群的发病率。养殖业使用禾维益生素，不仅仅可以调节机体的微生态平衡，促进机体对养分的吸收，而且不会造成药物残留和抗药性等问题，是很有希望代替抗生素的饲料添加剂。
四、禾维益生素该饲料添加剂可直接饲喂反刍动物，促进瘤胃发酵，改善营养成分在瘤胃中的消化与再合成，有效提高饲料的利用率和动物的抗病力，对于奶牛来说，可明显提高其产奶量。该产品具备安全、高效的特点，符合现代营养调控型添加剂发展的趋势，实现产业化生产后，预计将对我国奶牛养殖水平的提高做出重要贡献。
具体实施例方式
丝状真菌(菌种选育和菌种培植)--28～32℃菌种 接种---原料(玉米、米糠、豆、黄粉)----发酵罐---发酵----40～50h--菌体富集(离心机)-真空冷冻干燥机-低温干燥----包装机---成品乳酸菌(菌体选育和菌体培植)28～35℃---菌种-----接种------原料(玉米、米糠、黄粉、豆)--发酵罐---发酵---40～50℃---加填充料(1∶1)---35～50℃-----烘干粉碎----40～60目过筛---成品。
试验方法采样方法产品每批抽样5箱，每箱抽1瓶，无菌操作，每瓶吸取5毫升一同放入无菌的三角瓶中，摇均匀，瓶上粘贴标签，表明产品名称、取样日期、批号、取样人，供检验用。
感观指标的测定目测鼻嗅，无异臭味、黄褐色液体有效活细胞数和杂菌率的测定枯草芽孢杆菌活细胞数的测定枯草芽孢杆菌细胞测定用琼脂培养基的制备葡萄糖0.5g(NH4)SO4 0.2g柠檬酸钠 0.1gK2HPO4 1.4gKH2PO4 0.6gMgSO40.02g蒸馏水100ml纯化琼脂 2gpH 7.0确证实验枯草芽孢杆菌在琼脂培养基上菌落生长形态特征，菌落较大，直径3-10mm，灰白色、不透明，表面粗糙似毛玻璃状，边缘常呈扩展状。
用无菌吸管吸取5ml1号产品加入带玻璃珠的45ml无菌水中，静置20min后，充分震荡30min，混匀成1∶10稀释的菌悬液，这样依次稀释，分别得到1∶1×102，1∶1×103和1∶1×104等浓度(每个稀释度必须更换无菌吸管)。
用1ml无菌吸管分别吸取不同稀释度均悬液0.1ml，加至直径为9cm平皿的枯草芽孢杆菌细胞测定用琼脂培养基表面，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀地涂于琼脂表面。每个样品取3个连续适宜稀释度，每一稀释度重复3次，同时加无菌水的空白对照，好氧培养2-4天，培养温度为28℃-30℃，每个稀释度取5-10个菌落的菌体，涂片染色，显微镜观察识别后计数菌落。
嗜酸乳杆菌活细胞数测定嗜酸乳杆菌在琼脂培养基上培养，长成菌落，计数。其菌落的形态特征为平皿底为黄色，菌落中等大小，呈棉团状，微白色，湿润，边缘不整齐，直径3±1mm。计数步骤如下(1)用无菌吸管吸取5ml2号产品加入带玻璃珠的45ml无菌水中，静置20min后，充分震荡30min，混匀成1∶10稀释的菌悬液，这样依次稀释，分别得到1∶1×102，1∶1×103和1∶1×104等浓度(每个稀释度必须更换无菌吸管)。
(2)用1ml无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液0.1ml加至直径为9cm平皿的嗜酸乳杆菌细胞测定用琼脂培养基表面，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀地涂于琼脂表面。每个样品取3个连续适宜稀释度，每一稀释度重复3次，同时加无菌水的做空白对照，厌氧培养2～4天，培养温度为28℃～30℃，每个稀释度取5～10个菌落的菌体，涂片染色，显微镜观察识别后计数菌落。
嗜酸乳杆菌细胞测定用琼脂培养基的制备番茄汁50ml酵母提取液5g肉膏10g乳糖20g葡萄糖2g磷酸氢二钾2g吐温80 1g乙酸钠5g琼脂15g水加至1000ml PH 6.8±0.2嗜酸乳杆菌在琼脂培养基上菌落生长形态特征，平皿底为黄色，菌落中等大小，微白色，湿润，边缘不整齐，直径3±1mm，如棉团状菌落。
粪链球菌活细胞数测定粪链球菌在琼脂培养基上培养，长成菌落，计数。其菌落的形态特征为菌落呈红色或粉红色，边缘整齐，表面以下常呈椭圆或晶状体。其计数步骤如下(1)用无菌吸管吸取5ml2号产品加入带玻璃珠的45ml无菌水中，静置20min后，充分震荡30min，混匀成1∶10稀释的菌悬液，这样依次稀释，分别得到1∶1×102，1∶1×103和1∶1×104等浓度(每个稀释度必须更换无菌吸管)。
(2)用1ml无菌吸管分别吸取不同稀释度均悬液0.1ml加至直径为9cm平皿的粪链球菌细胞测定用琼脂培养基表面，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀地涂于琼脂表面。每个样品取3个连续适宜稀释度，每一稀释度重复3次，同时加无菌水的空白对照，厌氧培养2～4天，培养温度为28℃～30℃，每个稀释度取5～10个菌落的菌体，涂片染色，显微镜观察识别后计数菌落。
粪链球菌细胞测定用琼脂培养基的制备蛋白胨10.0g酵母浸膏10.0g氯化钠5.0g甘油磷酸钠10.0g麦芽糖20.0g乳糖1.0g叠氮化钠0.4g琼脂20.0g蒸馏水1000ml粪链球菌在琼脂培养基上菌落生长形态特征，琼脂平板上生长的红色或粉红色菌落，边缘整齐，表面以下常呈椭圆或晶状体，都是粪链球菌。
杂菌率的测定用无菌吸管吸取5ml产品加入带玻璃珠的45ml无菌水中，静置20min后，充分震荡30min，混匀成1∶10稀释的菌悬液，这样依次稀释，分别得到1∶1×102，1∶1×103和1∶1×104等浓度(每个稀释度必须更换无菌吸管)。
4.3.4.2用1ml无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液0.1ml加至直径为9cm平皿的琼脂培养基表面，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀地涂于琼脂表面。每个样品取3个连续适宜稀释度，每一稀释度重复3次，同时加无菌水的空白对照，好氧培养2～4天，培养温度为30～33 & ordm；C，每个稀释度取5～10个菌落的菌体，涂片染色，显微镜观察识别后计数菌落。
计算公式每一种活细胞数的计算都按下述方法进行，统计算出同一稀释度3个平皿上菌落平均数。
产品活细胞数＝菌落平均数×稀释倍数×10杂菌率(％)＝[杂菌数÷(有效菌数+杂菌数)]×100根据菌落特征判定，分别计算出产品中的特定微生物细胞数(以亿/ml表示)。
PH值测定仪器烧杯、酸度计。
测定方法随机取10ml样品置于干净烧杯内，预热PH计用标准溶液(PH 6.86)校正仪器后，测定样品的PH，边测边搅拌，仪器读数稳定后记录。每个样品重复三次。
出厂检验检验标准饲料级禾维益生素由公司的技术部门进行检验，应保证所有出厂的饲料级禾维益生素都达到本标准要求，每批出厂的饲料级微生物添加剂都应附有一定格式的质量合格证明，饲料级禾维益生素以每一发酵罐生产的产品为一批(3t)。
检验指标产品感官指标、有效活细胞数和汞、镉、砷、铅、大肠杆菌、沙门氏菌、霉菌的测定为出厂检验项目，由质检科按本标准检验方法进行检验。检验合格并签发合格证后方可出厂。
如果检验结果不符合标准规定时，应以加倍数量按规定选取试样进行检验，如仍不符合标准规定，该批产品判为不合格。
权利要求
1.一种由混合菌培养具有微生物活菌制剂和酶制剂的微生态制剂。
2.根据权利要求1所述的微生态制剂，其特征在于混合菌由乳酸杆菌芽孢杆菌、酵母菌、丝状真菌和光合菌的一种或一种以上菌组成的。
3.根据权利要求1所述的微生态制剂，其特征在于混合菌的培养基由黄豆粉、玉米、米糠、豆粕为主原料加上少量辅剂及微量元素组成。
4.根据权利要求1所述的微生态制剂，其特征在于该微生态制剂只含有活菌或包含菌体及其代谢产物的活菌制剂。
5.如权利要求1所述的微生态制剂的制备方法包括如下步骤(1)菌种选择选择①能够很好地同化基质碳源和无机氮源；②繁殖速度快，菌体蛋白含量高；③无毒性和致病性；④菌种性能稳定；⑤最好能进行混菌培养；(2)菌种培殖采用多菌种混菌培养要求菌株间菌种发酵以粗淀粉及渣粕为原料，菌株间存在存在同住或偏利生或共生关系，我们采用优良的细菌通过固体发酵粗淀粉原料及渣柏类原料；(3)培养基 由黄豆粉、玉米、米糠、豆粕为主原料加上少量辅剂及微量元素；(4)发酵及处理 菌种在上述培养基中往种子发酵，接种到发酵罐中28℃～32℃发酵；发酵40-50小时，过滤滤饼30-50℃烘干，粉碎；40-60过筛、光合菌在见光20℃环境下进行；加入矿物质和维生素、混合均匀制成。
全文摘要
本发明公开了一种由混合菌培养具有微生物活菌制剂和酶制剂的微生态制剂。该制剂由乳酸杆菌、芽孢杆菌、酵母菌、丝状真菌和光合菌的一种或一种以上组成的混合菌在一定培养基中培养，发酵温度28℃－32℃，发酵40－50小时，获及微生态制剂。该制剂具有调节机体微生态平衡，促进肠道的吸收分泌多种维生素和氨基酸等有益营养成分。改善机体机能。
文档编号C12N1/14GK1965673SQ20051011048
公开日2007年5月23日 申请日期2005年11月17日 优先权日2005年11月17日
发明者章定和, 沈孝煌, 张秋涛 申请人:上海绿其维生物科技有限公司