专利名称：一种细胞处理试剂盒及其使用方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞处理试剂盒及其使用方法，具体地说涉及一种用于临床检测用细胞标本的处理试剂盒及其使用方法。
背景技术：
细胞诊断学也称细胞病理学或临床细胞学，是将细胞制成细胞涂片，经细胞化学或免疫细胞化学方法显色，以细胞学为基础，组织病理学为指导，在细胞涂片中观察各种正常的和病理性的细胞，综合分析其病变性质，达到诊断疾病或病变的目的。细胞学诊断学可用于女性生殖道、食道、呼吸道、腹水、尿液等中各种脱落细胞的检查，也可用于乳腺、肝脏等细针穿刺得到的细胞，是一种临床应用非常广泛而又简便易行、经济有效的病理学诊断方法。
子宫是女性特有的重要器官，它分为宫体和宫颈两部分，宫体位于盆腔内，宫颈位于阴道内，宫颈与女性生殖活动及性生活密切相关。由于它的功能和所处位置，子宫颈病变是妇女最常见的疾患之一。据世界卫生组织(WHO)报道，全世界每年新发生的宫颈癌患者45万人。据统计，如果所有妇女每三年做一次常规巴氏检查，宫颈癌发病率将下降83％；如果使用液基细胞学检查，宫颈癌发病率将比不做检查下降92％。原因在于宫颈癌存在一个由可逆的癌前病变期到宫颈原位癌进而发展为宫颈侵润癌的连续发展过程，这些前驱病变可存在多年，而且子宫颈具有有利的解剖学位置，易于暴露，便于观察、触诊及取材，宫颈癌如能在前期病变阶段确诊治疗，宫颈癌不仅能预防，而且也完全能根治。
宫颈病变的检查方法归纳起来有①宏观诊查法妇科的肉眼观察、阴道镜检查、宫颈照相、荧光镜检法、触诊等；②微观组织细胞学检查法宫颈细胞学涂片的显微镜检查、活体组织病理学检查(活检)③病毒学检测。
宏观诊查法对于早期病变不容易判断其本质；活检虽然能准确断定疾病的本质，但要钳取宫颈活组织，对宫颈造成损伤，而且取材范围很有限；流行病学和生物学资料虽然证明人类乳头状瘤病毒(HPV)感染可能是宫颈癌及其癌前病变的主要病因，但不是唯一的原因，并不是所有的宫颈癌均由病毒引起，也没有证据表明HPV感染必然发展为宫颈癌。
宫颈细胞学涂片检查对人体没有损伤，患者无痛苦，且成本低，取材范围包括全部宫颈，能够直接观察到细胞水平的病变程度和本质，其重要作用早已为世人所公认，其最大价值之处还在于能早期诊断临床前期宫颈癌，因而是妇科门诊对宫颈癌筛查和排除的首选技术方法，定期筛查也是目前全世界预防宫颈癌的唯一方法。
宫颈细胞学涂片技术最初是将宫颈细胞采集器上黏附的含有脱落细胞的粘液直接涂抹于载玻片上，经染色后显微镜观察。该方法由希腊医生Papanicolaou发明，因而称为“巴氏涂片法(Pap Smear)”，于上世纪40年代开始作为宫颈癌筛查的一种手段引入临床，后来被许多国家作为常规筛查项目。因其方法简便，患者无痛苦，且成本较低，非常适合大范围人群的普查，至今几乎被一成不变地沿用了近半个世纪，是世界上第三个应用最广泛的检测系统，仅次于糖尿病和疟疾，有些地方仍然在使用。
但是，八十年代中、后期，发生在美国的宫颈涂片诊断假阴性病例的报导3，引起了人们的震惊。当对宫颈细胞学诊断的特异性和敏感性进行分析时，发现不同实验室均有相当可观的误诊率4。在对巴氏涂片技术的反思中，人们注意到假阴性病例的发生主要有以下三方面原因。
1.巴氏涂片法的缺陷①误诊率高本来是早期宫颈癌但不能发现，是假阴性，使癌症发展到晚期，导致死亡。传统巴氏涂片法的假阴性可达5％-30％。以下是近几年发表的关于传统巴氏涂片的假阴性调查研究结果
②敏感性低由于传统巴氏涂片检测敏感度的限制，检测宫颈癌的有效率仅为51％。
③假阳性高和重复性差检测的重复性差导致结果的不稳定，容易出现假阳性，不但会让病人负担不必要的近一步检查的花费，而且还对病人造成精神伤害。
3.巴氏涂片法导致缺陷的技术原因主要原因是该方法本身固有的标本处理缺陷导致的错误。
(1)收集器具上只有10％到30％的细胞能转移到载玻片上，其余的细胞均被抛弃，因而病变细胞可能被漏掉，不能全面反映病变；(2)涂片不能被干燥，应该在15到30秒钟内用固定液固定，但实际工作中很难做到，从而容易产生细胞变形的人为假象；(3)涂片上过多的粘液、红细胞、白细胞等，给阅片造成困难，容易产生阅读疲劳，不易发现病变细胞；(4)脱落细胞堆积、重叠，使不正常的细胞被遮盖，这都会严重影响细胞观察，很难做出准确判断。
针对这些问题，细胞学涂片新技术不断产生和发展，传统的巴氏涂片法逐渐停止使用，取而代之的是现代宫颈液基细胞学制片技术。
细胞病理学诊断包括三个连续的过程制片、染色、阅片，制片是整个细胞病理学的基础，是能否正确下诊断的先决条件。液基细胞学技术(Liquid Based Cytology，LBC)主要是指细胞病理学中的制片技术，是将收集到取材器具上的脱落细胞样本全部转移到细胞保存液中，通过各种特殊的处理方法去除无关细胞、粘液和其它干扰杂质，制成清晰的薄层细胞涂片。是现代细胞学标本制作方法的一次革命，它的优点是(1)几乎保留了取材器上的全部标本，不易漏检病变细胞，降低了假阴性的发生。
(2)避免了细胞过度干燥造成的人为假象，降低了假阳性的出现。
(3)去除了涂片上过多的粘液、红细胞、白细胞等与诊断无关的干扰因素，便于机器识别，人工阅读提高了阅片效率，减轻阅片者的疲劳，使阅片更不易出错。
(4)薄层涂片中的细胞不堆积、重叠，杂质少，背景清洁，细胞图像清晰，不正常细胞容易被观察，易于鉴别，提高了检测的敏感度。
自从上世纪末本方法出现以来已发展了二代技术产品第一代过滤膜分离技术细胞涂片系统其代表产品是Cytyc公司1996应用于临床的辛柏(ThinprepTM，又称TCT)。
主要方法是将宫颈脱落细胞洗入有细胞保存液的小瓶中，刮片毛刷在小瓶内搅拌十秒钟，再在该公司的机器上通过过滤膜过滤后，将标本中的杂质分离，取过滤后的上皮细胞制成直径为20mm薄层细胞于载玻片上，95％酒精固定，经巴氏染色、封片，由细胞学专家用肉眼在显微镜下阅片，按TBS法作出诊断报告。
第二代离心沉淀技术细胞涂片系统其产品是Tripath公司1999年进入临床使用的索柏(SurpathTM，又称LCT)。
主要方法是将宫颈脱落细胞洗入有细胞保存液的小瓶中，用该公司的机器比重离心，将标本中的黏液、血液和炎性细胞分离，收集余下的上皮细胞通过机器制成直径为13mm薄层细胞于载玻片上。每次机械自动化完成，可同时处理48份标本，同时完成细胞染色。
但是目前这些技术都是依赖机器完成，存在机器操作复杂、价格昂贵的缺点，无疑提高了医疗成本和患者负担。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种细胞处理试剂盒及其使用方法，以解决现有技术中存在的缺陷。
本发明的目的之一在于提供一种细胞处理试剂盒，该试剂盒包括以下几种试剂a.标本保存液组成包含如下重量百分比的组分30-50％的己醇、30-50％的异丙醇、9.8％的氯化钠和10-40％的Tris缓冲液；作用是用来固定、保存标本；b.分离清洗液含5-30％的多聚蔗糖和9.8％的氯化钠，用来清洗标本；c.包被稀释基液为0.005-0.02％的多聚赖氨酸水溶液，其作用是用来稀释和黏结细胞于载玻片上。
该试剂盒还包括一种细胞储备液，其成分为50-80％的己醇，用于剩余标本的保存备检。
本发明的另外一个目的是提供了该试剂盒的使用方法，该方法包括如下步骤A.将收集到的标本立即投入标本保存液中；B.将离心管中加入4毫升分离清洗液；C.标本在保存液中滞留30分钟以后，将标本保存液瓶置于漩涡混匀器振荡3分钟，充分混悬，倒入倾斜管壁的离心管，使标本保存液在分离清洗液的液面上；D.将离心管置于离心机离心5-15分钟；E.取出离心管，立刻倾倒上清液；F.在含有细胞沉淀的离心管中加入1-3倍于沉淀剩余物的包被稀释基液，置于漩涡混匀器振荡10-20秒钟；
G.用加样器吸取50微升细胞悬液，将移液器的吸头尖端轻轻置于用无水乙醇浸泡过的干燥载玻片上，将标本涂成1～2厘米的液膜，干燥，即可。
如果需要长期保存标本，将步骤E中所得到倾倒上倾液后的离心管内加5-10ml生理盐水，旋涡振荡器振荡0.5-1分钟，将剩余的标本洗涤，离心5-10分钟，弃上清，加入细胞储备液1-3ml，混匀，移入EP管封存。
该试剂盒是一种成本低，使用操作方便、快捷的细胞检测产品、其使用不需要特殊设备投资的产品，更多医院能够使用该产品，更多的人能够用得起该产品。
该试剂盒的总体优点概括如下
具体实施方式
实施例1
1.标本保存液组成包括己醇40％、异丙醇40％、氯化钠9.8％、Tris缓冲液10％；2.分离清洗液为20％的多聚蔗糖和9.8％的氯化钠溶液；3.包被稀释基液主要成分为0.01％的多聚赖氨酸水溶液；4.细胞储备液主要成分为70％的己醇。
实施例2细胞处理试剂盒的使用方法，包括如下步骤A将收集到的标本立即投入标本保存液中，如果使用头部可分离的标本取材刷，将标本刷的刷头投入标本保存液，旋紧瓶盖，移送制片实验室。
B将离心管中加入4毫升分离清洗液。
C标本在保存液中滞留30分钟以后，将标本保存液瓶置于漩涡混匀器振荡3分钟，充分混悬，轻轻倒入倾斜管壁的离心管，使标本保存液在分离清洗液的液面上。
D将离心管置于离心机离心10分钟，飘桶式离心机转速900g。
E从离心机内取出离心管，立刻倾倒上清液，并倒置于吸水纸巾上吸干管口剩余液体。
F在含有细胞沉淀的离心管中加入约两倍于沉淀剩余物的包被稀释基液，置于漩涡混匀器振荡15秒钟。
G用加样器吸取50微升细胞悬液，将移液器的吸头尖端轻轻置于用无水乙醇浸泡过的干燥载玻片上，采用边画同心园边推排液体的方式将标本涂成1～2厘米的液膜，置室温中干燥。
H将步骤E中倾倒上清液后的离心管内加5生理盐水，旋涡振荡器振荡一分钟，将剩余的标本洗涤，900g离心10分钟，弃上清，加入细胞储备液1ml，混匀，移入EP管盖紧封存。
实施例3细胞处理试剂盒的使用方法，包括如下步骤A将收集到的标本刷的刷头投入标本保存液，旋紧瓶盖，移送制片实验室。
B将离心管中加入4毫升分离清洗液。
C标本在保存液中滞留30分钟以后，将标本保存液瓶置于漩涡混匀器振荡3分钟，充分混悬，轻轻倒入倾斜管壁的离心管，使标本保存液在分离清洗液的液面上。
D将离心管置于离心机离心10分钟，桶式离心机转速1100g。
E从离心机内取出离心管，立刻倾倒上清液，并倒置于吸水纸巾上吸干管口剩余液体。
F在含有细胞沉淀的离心管中加入约两倍于沉淀剩余物的包被稀释基液，置于漩涡混匀器振荡15秒钟。
G用加样器吸取50微升细胞悬液，将移液器的吸头尖端轻轻置于用无水乙醇浸泡过的干燥载玻片上，采用边画同心园边推排液体的方式将标本涂成1～2厘米的液膜，置于不超过50℃的烘箱中干燥。
H将步骤E中倾倒上清液后的离心管内加5生理盐水，旋涡振荡器振荡一分钟，将剩余的标本洗涤，1100g离心10分钟，弃上清，加入细胞储备液1ml，混匀，移入EP管盖紧封存。
权利要求
1.一种细胞处理试剂盒，其特征在于该试剂盒包括以下几种试剂a.标本保存液包含30-50％的己醇、30-50％的异丙醇、9.8％的氯化钠和10-40％的Tris缓冲液；b.分离清洗液包含10-60％的多聚蔗糖和9.8％的氯化钠；c.包被稀释基液为0.005-0.02％的多聚赖氨酸水溶液。
2.根据权利要求1所述的细胞处理试剂盒，其特征在于还包括50-80％的己醇。
3.一种权利要求1或2所述细胞处理试剂盒的使用方法，其特征在于该使用方法包括如下步骤A.将收集到的标本立即投入标本保存液中；B.将离心管中加入4毫升分离清洗液；C.标本在保存液中滞留30分钟以后，将标本保存液瓶置于漩涡混匀器振荡3分钟，充分混悬，倒入倾斜管壁的离心管，使标本保存液在分离清洗液的液面上；D.将离心管置于离心机离心5-15分钟；E.取出离心管，立刻倾倒上清液；F.在含有细胞沉淀的离心管中加入1-3倍于沉淀剩余物的包被稀释基液，置于漩涡混匀器振荡10-20秒钟；G.用加样器吸取50微升细胞悬液，将移液器的吸头尖端轻轻置于用无水乙醇浸泡过的干燥载玻片上，将标本涂成1～2厘米的液膜，干燥，即可。
4.根据权利要求3所述的细胞处理试剂盒的使用方法，其特征在于还包括如下步骤将步骤E中所得到倾倒上倾液后的离心管内加5-10ml生理盐水，旋涡振荡器振荡0.5-1分钟，将剩余的标本洗涤，离心5-10分钟，弃上清，加入细胞储备液1-3ml，混匀，移入EP管封存。
全文摘要
本发明提供了一种用于细胞检测的细胞处理试剂盒及其使用方法，该试剂盒由标本保存液、分离清洗液、包被稀释基液组成，还可以包括细胞储备液，用该试剂盒处理细胞，操作简单、快捷，不需要特殊设备，成本低，细胞处理效果好，有利于增强检测的准确率，可广泛应用于临床和实验室。
文档编号C12M1/00GK1967193SQ20051011053
公开日2007年5月23日 申请日期2005年11月18日 优先权日2005年11月18日
发明者董建国 申请人:上海昂佰生物医学科技有限公司