专利名称：：功能强化型微生物群落的定向富集方法
技术领域：
：本发明涉及功微生物群落的定向富集方法。
背景技术：
：传统的微生物分离方法采用平板分离法反复纯化功能微生物直到获得纯培养的微生物，分离过程耗时很长，同时存在于自然界中的微生物只有很小一部分能获得纯培养，而且得到纯培养微生物应用于工程(或工艺)系统中存在应用于复杂生物过程系统中，纯培养微生物的功能效果较混和微生物要差；纯培养微生物应用于包含复杂底物的环境资源作培养基质时，纯培养微生物利用的底物范围有限，因此需要微生物种群多样的微生物资源；微生物在生物工艺系统和一些特定的环境中能被初步地定向富集，但无法获得功能微生物占绝对优势的功能微生物群落，即功能强化型微生物群落。
发明内容本发明的目的是为了解决现有微生物分离方法主要针对分离纯培养微生物，应用于工程(或工艺)系统中的功能差、利用的底物有限、耗时长及无法获得功能强化型微生物群落的问题，而提供的功能强化型微生物群落的定向富集方法。功能强化型微生物群落的定向富集方法按以下步骤实现一、原始微生物群落的母液梯度连续稀释，得稀释液；二、将稀释液分别接种于筛选培养基中培养，然后选择与母液功能指标相当的最大稀释倍数下的群落，再接种于筛选培养基中传代1020次，选择功能指标稳定的群落，即完成功能强化型微生物群落的定向富集。本发明功能强化型微生物群落的定向富集过程中，倍比稀释原始微生物群落一次，縮短了定向富集的时间，并且采用倍比稀释方法获得的微生物群落有利于其保持传代的稳定性；本发明中能够有效去除原始微生物群落中的非功能微生物，保留了原始微生物群落中关键的功能微生物，应用在工程(或工艺)系统中功能效果好、能够利用复杂的底物，且促进系统的快速启动及稳定高效运行。图1为具体实施方式四中铁还原筛选培养基中各种稀释倍数下的稀释液样品的Fe(III)还原历时图谱，其中令为10"稀释倍数下的稀释液样品，A为10—2稀释倍数下的稀释液，參为10J稀释倍数下的稀释液，口为104稀释倍数下的稀释液，A为10—s稀释倍数下的稀释液，B为10—6稀释倍数下的稀释液，x为10-7稀释倍数下的稀释液，|为10—8稀释倍数下的稀释液，〇为10一稀释倍数下的稀释液；图2为具体实施方式五中纤维素筛选培养基中各种稀释倍数下的稀释液的纤维素降解历时变化图谱，其中口为原瘤胃液，O为10"稀释倍数下的稀释液，A为10'3稀释倍数下的稀释液，V为10—5稀释倍数下的稀释液，<为10'7稀释倍数下的稀释液，>为10—9稀释倍数下的稀释液，O为10—u稀释倍数下的稀释液；图3为具体实施方式五中纤维素筛选培养基中各种稀释倍数下的稀释液的产氢量历时变化图谱，其中口为原瘤胃液，O为10"稀释倍数下的稀释液，A为10—3稀释倍数下的稀释液，V为10—5稀释倍数下的稀释液，<为10'7稀释倍数下的稀释液，>为10—9稀释倍数下的稀释液，O为10—u稀释倍数下的稀释液。具体实施例方式具体实施方式一本实施方式功能强化型微生物群落的定向富集方法按以下步骤实现一、原始微生物群落的母液梯度连续稀释，得稀释液；二、将稀释液分别接种于筛选培养基中培养，然后选择与母液功能指标相当且最大稀释倍数下的群落，再接种于筛选培养基中传代1020次，选择功能指标稳定的群落，即完成功能强化型微生物群落的定向富集。本实施方式步骤一中原始微生物群落为现有的各种微生物群落。本实施方式步骤一中母液为细胞悬浮液。本实施方式步骤一中原始微生物群落依据具体工程(或工艺)系统的功能要求来选择；选择经过初步驯化的工程(或工艺)系统微生物群落作为原始微生物群落，或者选择在一定选择压力环境中自然富集得到的微生物群落作为原始微生物群落。本实施方式步骤二中筛选培养基中培养根据筛选目标菌群在具体实施的工程(或工艺)系统的功能特点而设定的。本实施方式步骤二中稀释液在筛选培养基中培养的温度和时间是依据具体富集的目的功能微生物的生长特性设定的。本实施方式步骤二中选择与母液功能指标相当的最大稀释倍数下的群落，其中群落的筛选指标是依据具体工程(或工艺)系统的功能特点设定的。本实施方式完成功能强化型微生物群落的定向富集后，采用DGGE技术分析功能强化型微生物群落的微生物组成和数量。本实施方式完成功能强化型微生物群落的定向富集后，要将该微生物群落和原始微生物群落分别接种于原工程(或工艺)系统中，通过比较二者的功能效果，可以看出，本实施方式中所得功能强化型微生物群落的功能效果优于原始微生物群落。具体实施方式二本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中传代1218次。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式三本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中传代15次。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式四本实施方式功能强化型微生物群落的定向富集方法按以下步骤实现一、原始微生物群落的母液梯度连续稀释，得稀释液；二、将稀释液分别接种于筛选培养基中培养，然后选择与母液功能指标相当且最大稀释倍数下的群落，再接种于筛选培养基中传代15次，选择功能指标稳定的群落，即完成功能强化型微生物群落的定向富集。本实施方式步骤一中原始微生物群落来源于稳定运行八个月的双室MEC(微生物电解电池)或微生物燃料电池(MFC)阳极碳布上的生物膜；母液的制备是将阳极碳布上的生物膜置于磷酸缓冲溶液中，振荡后即得。本实施方式步骤二中筛选培养基为铁还原筛选培养基，其中电子供体为10mM乙酸，电子受体为100mM无定形铁(不溶于水的Fe(III))。本实施方式中稀释液在铁还原筛选培养基中培养的温度是30°C，时间是264h。本实施方式中以MFC或MEC系统中Fe(III)还原能力为功能指标，实验结果如图1所示，经过264h的培养，浓度稀释为原母液10"-10—6的稀释液中5均检测到Fe(II)的生成，且Fe(II)浓度都达到了2530mM水平；稀释倍数达到或超过10—7的稀释液中没有检测到Fe(II);因此，选择浓度稀释为原母液10'6的稀释液为定向富集的MFC或MEC系统中的功能强化型微生物群落，即阳极微生物功能群落(anodophilicfunctionalconsortium,AFC)。本实施方式完成功能强化型微生物群落的定向富集后，采用DGGE技术分析功能强化型微生物群落的微生物组成和数量；分析表明AFC的微生物群落落组成主要包括土杆菌属(Geo^cter)、假单胞菌属(P^i^omoww)和梭杆菌属(C7o^^Mm)，并且这三个菌属都是MFC或MEC系统中的产电菌。本实施方式中在铁还原筛选培养基中传代15次的功能强化型微生物群落，即AFC，将其与污水处理厂的活性污泥分别接种于两个相同的MFC反应器中，比较二者的功率密度、库伦效率和启动效果；结果如图1所示，AFC的输出功率大，启动反应器快，在一个完整的周期中AFC获得的库伦效率要远高于活性污泥，说明获得的AFC具有较高电化学活性，能促进MFC的运行效果。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>具体实施方式五本实施方式功能强化型微生物群落的定向富集方法按以下步骤实现一、原始微生物群落的母液梯度连续稀释，得稀释液；二、将稀释液分别接种于筛选培养基中培养，然后选择与母液功能指标相当且最大稀释倍数下的群落，再接种于筛选培养基中传代12次，选择功能指标稳定的群落，即完成功能强化型微生物群落的定向富集。本实施方式步骤一中原始微生物群落的母液来源于牛瘤胃液。本实施方式步骤二中筛选培养基为纤维素筛选培养基，其中纤维素浓度为10g/L。本实施方式中稀释液在纤维素筛选培养基中培养的温度是37°C，时间是160h。本实施方式中以产氢量和纤维素降解度为功能指标，实验结果如图2所示经过160h的培养，浓度稀释为原母液10"-10'7的稀释液能降解纤维素，且与母液功能指标相当；如图3所示有0.280.32g的纤维素经微生物的降解生成120145ml/L的H2;浓度稀释为原母液1(T910—11的稀释液中的纤维素在160h内没有被其中的微生物降解；因此，选择浓度稀释为原母液1化7的稀释液为定向富集的纤维素产氢系统中的功能强化型微生物群落，即瘤胃液纤维素降角早功能微生物群落(mmencellulose-degradingbacterialconsortium,RCBC)。本实施方式完成功能强化型微生物群落的定向富集后，采用DGGE技术分析功能强化型微生物群落的微生物组成和数量；分析表明RCBC的功能微生物组成主要是瘤胃菌属、琥珀酸弧菌和丁酸弧菌属；群落分析同时还发现在浓度稀释为原母液10力10—n的稀释液中瘤胃球菌消失了，可能是这类关键微生物的丢失破坏了微生物群落内的协同作用，导致过高稀释倍数下的稀释液失去功效。本实施方式中定向富集的RCBC与原瘤胃液各自的纤维素降解率和产氢量，经测试RCBC在发酵过程中纤维素降解量比原瘤胃液的高；RCBC在发酵过程中产氢量不变，而原瘤胃液在发酵过程中产氢量在后续的时间里逐渐被消耗了，这表明在原瘤胃液中存在着某些耗氢微生物，而这种现象在定向富集得到的RCBC中没有出现。权利要求1、功能强化型微生物群落的定向富集方法，其特征在于功能强化型微生物群落的定向富集方法按以下步骤实现一、原始微生物群落的母液梯度连续稀释，得稀释液；二、将稀释液分别接种于筛选培养基中培养，然后选择与母液功能指标相当且最大稀释倍数下的群落，再接种于筛选培养基中传代10～20次，选择功能指标稳定的群落，即完成功能强化型微生物群落的定向富集。2、根据权利要求1所述的功能强化型微生物群落的定向富集方法，其特征在于步骤二中传代1218次。3、根据权利要求1所述的功能强化型微生物群落的定向富集方法，其特征在于步骤二中传代15次。全文摘要功能强化型微生物群落的定向富集方法，它涉及功微生物群落的定向富集方法。它解决了现有微生物分离方法主要针对分离纯培养微生物，应用于工程(或工艺)系统中的功能差、利用的底物有限、耗时长及无法获得功能强化型微生物群落的问题。方法一、原始微生物群落的母液梯度连续稀释，得稀释液；二、将稀释液分别接种于筛选培养基中培养，然后选择与母液功能指标相当的最大稀释倍数下的群落，再接种于筛选培养基中传代，选择功能指标稳定的群落，即完成功能强化型微生物群落的定向富集。本发明倍比稀释原始微生物群落一次，缩短了定向富集的时间，应用在工程(或工艺)系统中功能效果好、能够利用复杂的底物，且促进系统的快速启动及稳定高效运行。文档编号C12N1/00GK101497862SQ20091007145公开日2009年8月5日申请日期2009年2月27日优先权日2009年2月27日发明者充刘,刘文宗,丹孙,王爱杰,程浩毅,高灵芳申请人:哈尔滨工业大学