专利名称：快速微生物分析方法
技术领域：
本发明涉及一种快速微生物分析方法。
背景技术：
目前，检测工业和医疗活动中的液体、气体或表面的微生物的量必须遵守严格的标准。
因此，工业健康安全机构必须具有尽可能快速地检测微生物污染的手段，以便能够在最佳时间以最少的费用进行补救。
实践中，微生物监测在凝胶介质上进行，将收集在一个微孔膜上的微生物在所述凝胶介质上培养直至其可为肉眼所见。
不同的微生物的温育时间不同，但通常至少24小时，有时对于生长较慢的微生物(例如分枝杆菌属(mycobacteria))或者因为所述微生物已被其环境条件应激而会更长。
一种加速检测的方法是通过将微生物的检测基于其代谢活性而减少最少培养时间(或者甚至在某些微生物的情况下完全不需培养)。
通过将活的微生物中含有的一种通用代谢标记物，三磷酸腺苷(ATP)与一种生物发光试剂接触以通过发光显示ATP的存在，从而可以检测微生物的存在而不用等待在凝胶介质上形成肉眼可见的菌落。
发射的光的量是ATP量的函数，因此也是微生物数的函数。
已知在测试溶液中计数活的微生物数的方法，特别是根据欧洲专利0 529 084，这种方法包含如下步骤
-通过微孔膜过滤所述溶液以滞留所述溶液中含有的活的微生物；-喷洒一种制剂，其可以使微生物的ATP可被之后喷洒的并且通过发光显示ATP存在的一种试剂触及；-然后向膜上喷洒那种试剂；及-根据对所述试剂沉积的响应而发射的光的量检测微生物的存在。
发明内容
以这种方式测量的光的量一方面来自响应试剂与ATP发生化学反应而发出的光，另一方面来自于通过可消耗(不管是否存在微生物)而发出的“背景光”。
这种背景光具有多种光源，例如由多种材料发射的自然光(通过磷光、荧光或热辐射)。
为了可靠地确定微生物存在于膜上，因此必须将只是由于试剂与ATP相接触发出的光与“背景光”区分开来。
一种方案是通过实验方法建立区分阈值，在该区分阈值之外，发射的光可被认为不仅是由背景噪声引起，而且由存在的微生物引起。
为此，对多组消过毒的膜进行处理并对响应该处理发出的光进行分析。
对每一组，如果分析结果错误地显示(这些结果被称为假阳性)微生物存在于一或多个消过毒的膜上，然后因此调整该阈值，直到对于一组膜没有检测到假阳性。
本发明的目的在于增加这种分析结果的可靠性，同时便于使用。
为此，本发明提出一种适于滞留微生物的支承物的快速微生物分析方法，包括选择适于通过发光显示ATP存在的试剂的步骤以及作用于所述微生物以使所述微生物的ATP可被所述试剂触及的步骤；然后将所述试剂沉积在所述支承物上的步骤；以及检测所述支承物对所述试剂的响应的步骤；其特征在于，所述检测步骤包括记录由所述支承物发出的、作为在进行所述沉积步骤的时刻t0之前的时刻t1到所述时刻t0之后的时刻t2之间的时间的函数的光的量的步骤；从所述记录的光的量外推到在未沉积所述试剂情况下在所述时刻t1到所述时刻t2之间由所述支承物发出的、作为时间的函数的光的量的步骤；以及由所述记录的光的量和由所述外推的光的量确定一组仅仅是由于所述试剂与ATP相接触而发出的、作为从所述时间t0开始的时间的函数的光的量的数值的步骤。
在本发明的方法中，只有一个测量(在被分析的支承物上)需要隔离需要的信号。从该测量通过计算外推出背景光，而不需要对同一支承物或其它支承物进行附加的测量。
此外，对于将被分析的新的支承物的每个新的测量，确定背景光以更新用于每个新的支承物的数据。
因此，本发明的方法利用单一测量以增加的精度确定只是由于试剂与ATP便利地接触而发出的光的量。
根据本发明的优选便于和利于制造和使用的目的的特征确定所述一组数值的所述步骤包括确定所述记录的光的量和所述外推的光的量之间的差值的步骤；在确定所述一组数据的步骤之后，检测步骤还包括对所述一组时间函数的数值进行积分的步骤；以及将所述积分结果与预定数值进行比较以推断微生物的存在的步骤；和/或在确定所述一组数值之后，检测步骤还包括选择所述一组数值的最大值的步骤；将所述选择的结果与预定数值进行比较以推断微生物的存在的步骤；根据其它优选特征，为了进一步增加结果的可靠性，所述检测步骤还包括区分假阳性的步骤，该步骤包括实施至少一个如下测试的步骤-证实在时刻t0之后所述支承物发射的光的量随时间减少；-证实试剂沉积引起的光的突变的幅度大于预先确定的值；-证实相对于试剂沉积之前的光的量，在所述试剂沉积之后的预定时间，光的量仍然大于预先确定的值；-证实在所述试剂沉积之后，所述支承物发射的光的量的减少不同于所述试剂沉积之前所述支承物发射的光的量的减少，和/或-证实所述支承物发射的光的量大于预先确定的阈值的时间大于预定时间；
在实施了至少一个上述测试的步骤之后，如果至少一个所述测试的结果是阴性的，表示存在假阳性的步骤。
该区分步骤使得可确保获得的结果不是由于外部现象引起，而是确实由于在支承物上存在微生物而引起的。
根据本发明的与前述原因相同的其它优选特征所述记录步骤包括-选择光电倍增器(photomultiplier)的步骤；-将所述支承物面对所述光电倍增器放置的步骤；-在所述时刻t1打开置于所述光电倍增器前面的关闭件的步骤；-测量在所述时刻t1和所述时刻t2之间被所述光电倍增器接收到的光的量的步骤；及-在存储器中存储所述测量结果的步骤。
所述外推步骤如下进行计算对数函数系数，其作为时间的函数减少并根据未沉积所述试剂的所述支承物发射的光的量而变化；和/或所述外推步骤基于在所述时刻t1和所述时刻t0之间记录的光的量。
根据本发明的与前述原因相同的其它特征所述外推步骤基于在所述时刻t0+x和所述时刻t2之间记录的光的量，其中x是预定的期间。
以如下方式确定期间x，即，使得在所述时刻t0+x之外，沉积试剂对由支承物发出的光的量的影响可忽略。
根据本发明的与前述原因相同的其它特征通过发光显示ATP存在的所述试剂是基于荧光素-荧光素酶的试剂；作用于所述微生物的所述步骤包括裂解所述微生物的步骤；所述裂解步骤通过加热所述支承物进行；所述加热步骤包括将所述加热温度升高至从50℃至150℃的一个值的步骤；所述加热步骤包括将所述加热温度升高至从70℃至100℃的一个值的步骤；所述支承物通过微波加热；作用于所述微生物的所述步骤包括使所述微生物可透过的步骤；所述使所述微生物可透过的步骤包括将适于使所述微生物可透过的试剂喷洒到所述支承物上的步骤；所述支承物是微孔膜。
通过如下优选但非限制性实施例并参考所附附图描述了本发明的特征和优点，其中-图1是快速微生物分析装置的透视图，示出了所述装置的活动托架处于容纳过滤单元的位置；-图2是比图1所示的装置比例更大的、通过所述托架轨道中心的竖直平面的截面透视图；-图3和4是与图2相似的两张图，分别示出了在第一位置和第二位置处理所述过滤单元的膜的活动托架；
-图5和6分别是比图3比例更大的、不同角度的截面透视图；-图7是计时图，用常规时标(横轴)和常规百分比刻度(纵轴)示出了当将包括所述过滤单元的膜加热至90℃时，事先沉积在膜上的试剂的残留活性的比率和膜上存在的第一和第二种类型的微生物的裂解比例如何作为时间函数进行变化；-图8是计时图，用常规时标(横轴)示出了在沉积用于通过发光显示ATP存在的试剂之前、期间和之后，所述膜及其紧邻环境发射的光的相对量和未沉积所述试剂时将会发射的光的量；-图9是类似图8的计时图，但是离散示出了仅仅由于将所述通过发光显示ATP存在的试剂与膜上微生物接触而发射的光的量；-图10是所述装置的模块图，特别示出了该装置的微计算机；-图11是通过微计算机对所述装置的光电倍增器提供的数据进行操作的流程图；及-图12是计时图，用常规时标(横轴)示出了在沉积通过发光显示ATP存在的试剂之前、期间和之后，针对非需要ATP的不同起始量，所述膜及其紧邻环境发射的光的量如何变化。
具体实施例方式
过滤单元15的快速分析装置1包括喷洒工位2、裂解工位3和光测量工位4。
喷洒工位2和测量工位4相对，并且裂解工位3在站2和4的附近。
喷洒工位2包括通过管22与未示出的烧瓶连接的喷嘴21。
喷嘴21具有圆锥形头部25，并且通过板23固定于所述装置的框架上(未示出)。
管22连接的烧瓶含有基于水、荧光素-荧光素酶复合物和镁通过发光显示ATP存在的试剂。所述烧瓶携带具有与所述试剂相关信息的RFID芯片，所述信息如烧瓶中含有的试剂的初始体积，所述试剂的保质期或者使用烧瓶中剩余体积的试剂可以进行的循环数。
裂解工位3包括大致为平行六面体形状的封罩30和通过同轴电缆(未示出)与封罩30内的天线(不可见)连接的磁控管31(在图1中用其电子控制板表示)。
如喷嘴21的板23一样，磁控管31及其控制板被安装于所述装置的框架上(未示出)。
封罩30具有上封罩部28，下封罩部29和U形截面钳32。
每个封罩部都是大致平行六面体形状并具有一个开口面。
封罩部28(或者29)在其开口面周围具有一个与封罩部其余部分横向连接的矩形轮廓凸缘41(或者42)。
U形钳32具有通过横向小分支45连接在一起的两个大分支43。
在组装的状态，每个凸缘41、42与钳32的分支协作使得封罩部28和29的开口面面对面放置。
封罩30的封罩部28、29和钳32具有使磁控管31在封罩30限制的腔内产生驻波的尺寸。
在组装的状态，在分支43之间和凸缘41和42之间的、与分支45相对的封罩侧的空间通过窗39朝向喷洒工位2和测量工位4方向打开。
在窗39的附近，有一个用于阻挡这个窗的挡板68以便将喷洒工位2和测量工位4与磁控管31所产生的电磁干扰相隔离。
测量工位4包括通过工作台51的光电倍增器50和关闭件52(图6)。
光电倍增器50是Electron Tubes9266B光电倍增器。
关闭件52在图6中详细示出，其包括不透明板53、杆56、曲柄55和马达54。
板53是活动的且容纳在工作台51形成的腔中并通过杆56与曲柄55连接。
装置1还包括具有板12和边沿9的托架5(图2-4)。板12通过两个螺钉7固定于边沿9上(图1)。
板12中的柱状孔开口在板的每一侧上。
这个孔的两侧是相对于板12的每一侧为凹陷的环形凸缘13。
板12面向光电倍增器50的一侧上的凹槽安放玻璃窗17。
过滤单元15包括围绕微孔膜19的本体18，膜19具有两个相反面10和11。
托架5上的边沿9通过用螺钉8固定在该边沿上的带64以及一组滑轮62、63和67与位于封罩30外部在钳32的分支45附近的马达65连接(图1和2)。
并且为可以卷绕在滑轮上，带64具有曲线截面，使其获得抗弯强度，从而使其可以传送推力。
带64通过窗39和在钳32的小分支45中形成的扁长形孔46穿过封罩30(图2-4)。
托架5固定于所述带上以在接收位置(图1和2)、第一处理位置(图3、5和6)和第二处理位置(图4)之间活动托架。
在马达65的相反侧，装置1还包括窗60和可以使窗60在关闭时不透光的盖61。
在接收位置，盖61打开，板12通过窗60从装置中伸出。
在第一处理位置，托架5处于喷嘴21和光电倍增器50之间，结果在这个位置喷洒工位2面向膜19的面10并与其对准，而测量工位4通过窗17而面向膜的面11并与其对准。
在接收位置和第一处理位置，带64完全穿过封罩30。
在第二处理位置，托架5处于裂解工位3的封罩内以便膜19完全处于这个封罩内且边沿9在凸缘41和42之间。
在不同处理工位的传感器监测所述装置的运行状态，特别是监测含有所述试剂的烧瓶旁的RFID读数器/记录器、多个托架位置传感器和多个温度传感器(例如针对光电倍增器和磁控管的那些传感器)。
喷洒工位2、裂解工位3、测量工位4、马达54和65以及多个传感器与微计算机82连接，如图10流程图所示。
微计算机82特别可以执行启动或停止分析循环的指令、通过人-机界面85接收来自操作者的指令和在存储器中存储来自光电倍增器的数据。微计算机82还可以在屏幕83上显示和/或通过标记印字机84打印操作者使用的信息(例如当前循环的进展、烧瓶中还有的循环数、先前分析结果和多种装置报警和维护报告)。
下面描述装置1的操作。
进行分析循环之前，操作者收集可能存在于液体或气体中或在过滤单元15的微孔膜19表面上的所有微生物。
在选择用于与过滤单元的本体18协作的适当板12并将其用螺钉拧紧在边沿9上之后，操作者然后将过滤单元15置于活动托架5(此时其在图1和2所示的接收位置)上，相对于凸缘13对中，然后过滤单元15的本体18的下边沿搁靠在这个凸缘上。
使用人-机界面，操作者命令开始膜分析循环。
特别地，操作者可以选择3个不同的循环，即无预处理的循环、“人工”预处理循环和自动预处理循环。
人工预处理循环的几个步骤如下所述。
首先，控制模块驱动马达65以转动滑轮62、63和67以平移移动活动托架5。
这将托架从其接收位置移动至其位于喷洒模块2和测量模块4之间的第一处理位置(图3)。在移动期间，当托架5全部通过窗60时，该装置的盖61(其被弹性加载)闭合，在封闭和黑暗环境中进行随后的步骤。
在第一处理位置，工位2喷洒预定体积的试剂。喷嘴21设计为在整张膜19上均质规则沉积所述试剂的微滴。喷洒微滴充分地将沉积的试剂体积分开以避免任何稀释风险。
因此将所述试剂与膜上非需要ATP接触，该ATP不是来自膜上滞留的微生物，而是来自外部例如在运送或过滤过程中的污染。
将所述试剂与非需要ATP接触导致产光和消耗非需要ATP的化学反应。以这种方式消耗的非需要ATP将不干扰随后的分析循环步骤。
所述试剂不与微生物的ATP相互作用，在循环的这个阶段，其仍被微生物细胞壁保护不与试剂接触。
当喷洒所述试剂时，控制模块驱动马达65将托架5通过窗39移动至封罩30中以到达裂解工位3的微波腔内的第二处理位置。
当托架5被送入封罩30中时，被弹性加载的挡板68闭合，将封罩30与装置其它部分分离，并使微波发射引起的电磁干扰最小化。
然后磁控管31发射单波场，以便入射波在由封罩30形成的微波腔中传播。在封罩中建立驻波(由于封罩30表面反射入射波造成)。
凸缘41和42的、位于窗39附近的部分和开口46也辅助最小化通过这些开口的磁场泄漏。
被微波场激发，极化的分子(特别是过滤后膜上含有的和/或第一次喷洒所述试剂产生的水分子)将膜19加热至大约90℃的温度。
在此温度，膜上试剂被快速消除，如图7中曲线75所示，其以时间函数表示仍有活性的试剂比率(残余活性水平)。
暴露于这个温度6秒后，消除了20％的所述试剂，15秒后，消除了90％的的所述试剂，17秒后，消除了所有试剂。
在这个温度处微生物裂解动力学较慢。图7中曲线76和77以时间函数表示对于两种类型的微生物(曲线76表示酿酒酿母(Saccharomyces cerevisae)，曲线77表示隐球菌属(cryptococcus))而言被裂解的微生物百分比。注意在所有试剂被消除的时间处只有少量的微生物被裂解。
因此，在预先沉积的所述试剂被消除前，大多数微生物的细胞壁尚未发生裂解(因此所述微生物的ATP还不可触及)。因此，大部分的微生物ATP未被所述试剂消耗。
再者，因为温度升高导致部分干燥了膜19，而使得热量在消除试剂时更有效，所以试剂的消除是被加速的。
微波加热表示仅是所需量的能量被输入，其是膜上存在的水的量的函数，而不产生干扰随后处理步骤的残余热量。
在该加热步骤之后，可对已经被裂解的微生物的ATP进行分析。然后马达65运行以将托架5移出封罩30，返回第一处理位置，之后测量工位的关闭件52的马达54运行转动曲柄55，将不透明板53移至远离光电倍增器50的位置(图3)。
然后，光电倍增器测量通过其窗17接收到的、位于光电倍增器的“视野”中的材料(此处为膜19及其紧邻环境)发射的光的量。
参考图11的流程图，下面描述关闭件打开时通过微计算机进行的操作。
在操作90中，从时刻t1(此处为30s)至时刻t2(此处为300s)，微计算机记录由光电倍增器传送的测量数据。
在时刻t1之后和t2之前的时刻t0(图8)，喷洒工位2将烧瓶中含有的所述试剂的微滴第二次规则均质沉积在整个膜19上，同时继续记录光的量。
光发射自膜19和板12的两侧，这是因为膜的厚度小以及为此目的在板12中形成的孔所致。
图8中曲线78表示了作为时间函数的、以相对光单位(RLU)记录的光的量，所述曲线示出光的量对于时刻t0以正则对数方式减少，t0对应于所述试剂喷洒到膜上的时刻。
这种减少模式相应于通过位于所述光电倍增器视野中的材料发射的天然光子磷光而去激发(deexcitation)。
在时刻t0之外，由于试剂与通过裂解步骤而可被触及的微生物ATP相接触而导致光发射的突变。
在这个突变之后，光的量再次以对数方式减少。
使用记录的数据，微计算机执行操作91并以时间函数外推在所述试剂未沉积在膜上时将会发射的光的量。
在这个例子中，这个操作基于从ti(50s)至t0(100s)记录的数据以及从t3＝t0+x至t2(300s)记录的数据，其中选择x以便t3充分远离t0，可认为超出t3后增加试剂的影响可忽略(此处t3＝250s)。微计算机由记录的数据推导出从t1到t0和从t3到t2整体变化的、由曲线78表示的光的量的对数函数的参数。
在本实施例中，该函数是Q(t)＝-16518.1n(t)+120334并由图8中的曲线79表示。此处，在时间间隔[t1，t0]和[t3到t2]中，记录数据和由外推函数得到的数据之间的相关系数是0.09994。
曲线78和79在下限为t0(100s)的、试剂被喷洒的时间间隔(此处间隔为[100s，150s])中明显不同。
通过操作92，微计算机然后由分别由曲线78和79表示的记录的光的量和外推的光的量来确定一组作为时间函数的、仅仅是由于微生物的ATP与试剂接触得到的光的量的数值。该组数据由图9中的曲线80表示。
在本示例中，在每次从t1到t2的光量值被记录的期间，微计算机计算所述数值与由外推函数Q(t)给出的同一时刻的数值之间的差值。
这种一点一点的减少以数字方式过滤掉了不期望的光背景噪声(减白，“decreasing white”)以获得对应于仅来自微生物的ATP的光的量的一组值。
过滤背景噪声消除了存储条件(其对于自然光的发射的影响是很重要的)、沉积或过滤在膜上的产物的自然特性(根据其组成发射光本身)、以及实验分析条件(不透光、热干涉、光电倍增器的效率)的影响。
然后对以这种方式过滤的光的量从时刻t1到时刻t2求积分(操作93)，并进行将该积分的结果与使用者需要的微生物检测灵敏度对应的阈值进行比较的测试(94)。
此外，由于包含在微生物中的ATP的量可根据微生物的类型而明显不同，因此选择该阈值的值作为要检测的微生物的类型的函数。
如果积分结果高于阈值，则认为ATP产生光是由膜上存在微生物而导致的。
相反，如果积分结果低于阈值，则认为不存在足以认为微生物存在于膜上(以足够大的量存在)的足够量的ATP。
然后微计算机通过执行操作95或操作96将适当的信息显示在装置的屏幕上(作为测试94的结果的函数)。
一旦已经进行了分析，控制模块将托架5从第一处理位置移动到接收位置，在该接收位置，操作者可去除已经被分析过的过滤单元15并由将要被分析的下一单元替换。
测量工位4和喷洒工位2相对于膜19在第一处理位置的沉积是指光电倍增器50尽可能地靠近膜19并相对于其横向布置，而不会被喷洒工位阻止以及阻止喷洒工位。这种结构收集最大量的光并因此使光电倍增器的检测灵敏度最优化。
此外，使用具有薄的不透明板和远的打开关闭机构的关闭件进一步减小光电倍增器50和膜19之间的距离，并增加了检测灵敏度。
该装置的这种结构，预处理步骤和记录的光信号的数据处理使得检测装置具有高灵敏度。
上述类型的装置可检测只有大约10毫微微克的ATP的存在。
这种灵敏度是指可检测到较广种类的微生物，并且可检测到膜上的单种微生物的存在而不用温育。
下面描述在自动循环的情况下执行的预处理步骤。
自动分析循环确保所有非需要的ATP已经被消耗掉。
图12表示了在时刻t0沉积试剂用于还没有被消耗的非需要ATP的不同的量(曲线78A情况中的170毫微微克、曲线78B情况中的66毫微微克、曲线78C情况中的52毫微微克和曲线78D情况中的18毫微微克)之前和之后记录的光的量，没有被消耗的非需要的ATP可大量存在并产生错误的结果(检测“假阳性”尽管膜上不具有任何微生物，但检测到微生物的存在)。
因此，为使用者提供这样一个循环是有利的，该循环确定预处理步骤已经消耗掉了所有非需要的ATP。
在进行裂解微生物之前，利用在第一处理位置的托架5和在同一时刻喷洒试剂，关闭件52被打开以便使光电倍增器50在喷洒过程中连续测量由膜和其紧邻环境发出的光的量。微计算机将该测量值与预定的阈值比较，并且只要由光电倍增器测量的光的量高于该阈值，试剂的喷洒就持续进行。
当测量的光的量低于该阈值时，仍存在于膜上的、未消耗掉的非需要的ATP的量被认为是可以忽视的，并且喷洒停止。托架然后移动到第二处理位置以继续分析循环。
在一个变化例中，不对与由曲线80表示的光的量相对应的所有的值进行积分，而是微计算机可从该组中选择最大值并将其与预定的阈值进行比较。
另一变化例用于使膜被红外线装置加热。
另一变化例是由喷洒试剂替代热解步骤以实现微生物的化学裂解或使微生物能透过膜从而使它们包含的ATP可接触随后喷洒的试剂以通过发光来显示ATP。
又一变化例是利用CCD摄像机替代光电倍增器或通过一次一个单元区域地处理和/或分析膜几次以使用该装置计算膜上的微生物。
在又一变化例中，还可通过其它附加标准分析来确认通过对区域进行积分计算得到的结果或最大值，从而可以确保所获得的结果不会因外部干扰而失真。
该分析是对在t1和t2之间测量的、由图8中的曲线78表示的光量的特点的研究。
因此，可对下面将要说明的一个、几个或所有标准进行研究。
第一标准包括证实在时刻t0之外的光量减少(负斜率)。这是因为如果斜率是正的，将意味着在由喷洒试剂引起的光的突变之后光量继续增加，这与刚刚被喷洒的试剂的消耗过程中光量减少的事实相矛盾(见t0和t2之间的曲线)。因此在这种情况下这种现象不是通过存在的微生物与试剂相接触而发光得到，而是通过外部现象(假阳性)得到。假阳性意味着表示在膜上存在微生物的错误结果。
第二标准证实在试剂的沉积上的光的突变的幅值大于预定的阈值(例如100RLU)，以确保由喷洒引起的光的阶跃足够大并因此实际上通过放置试剂与膜上的微生物相接触而产生。
第三标准包括证实相对于试剂沉积之前的光量，在试剂沉积之后一预定时刻(此处t0+50s)处的光量保持大于一预定值(例如100RLU)，以确保通过放置试剂与膜接触而产生的光的阶跃保持很大，即使在距离喷洒很远的时刻。因此该标准使得可不在阳性结果中保持光的“峰值”，其明显只具有小的暂时宽度并且因此明显不是由于存在微生物而引起而只是由于例如膜从干的状态到湿的状态的简单转变而产生。
第四标准包括证实在试剂沉积之后由支承物发出的光的量与在沉积之前由支承物发出的光的量以不同的方式减少。
这是由于如果在喷洒之前和之后(突变是唯一的不同)光的量以相同方式减少(具有相同的斜率)，则意味着这种减少只与受到环境光的膜的简单去激发(deexcitation)相关，而不是通过将膜上存在的微生物放置成与喷洒试剂相接触而引起(假阳性)。
第五标准包括证实在喷洒后获得的信号保持高于预先确定的阈值(例如100RLU)的时间大于预定时间(例如10s)以便不保持光的峰值为阳性，它们明显不是由于在膜上存在微生物而导致的。
这些标准可彼此独立地证实，每一个可证实或驳倒下面的情况响应喷洒试剂发出的信号是由于存在微生物。
只要这些实验中有一个是阴性的，微计算机在装置的屏幕上显示信息警告使用者支承物的分析导致了所获得的结果是假阳性的结论。
在一个没有示出的变化例中，在t1和t2之间没有连续记录，而是例如在以t0为中心的短时间内暂停(例如为了在喷洒工位和测量工位不是彼此面对而是彼此相邻的情况下可使托架移动)，和/或外推只是基于在喷洒试剂之前记录的数据进行(在t1和t0之间获得的数据)。
如果在t0的附近记录被中断，则使用外推曲线确定刚好在喷洒试剂(其在t0处进行)之前光量的值，以便可以在尽管缺少刚好在t0时刻之前的记录的情况下确定光阶跃的幅值。
本发明不限于所描述和示出的实施例，其包含任何可实施的变化例。
权利要求
1.适于滞留微生物的支承物(19)的快速微生物分析方法，包括选择适于通过发光显示ATP存在的试剂的步骤以及作用于所述微生物以使所述微生物的ATP可被所述试剂触及的步骤；然后将所述试剂沉积在所述支承物(19)上的步骤；以及检测所述支承物(19)对所述试剂的响应的步骤；其特征在于，所述检测步骤包括步骤(90)，在该步骤记录由所述支承物(19)发出的、作为在进行所述沉积步骤的时刻t0之前的时刻t1到所述时刻t0之后的时刻t2之间的时间的函数的光的量；步骤(91)，在该步骤从所述记录的光的量外推到在未沉积所述试剂情况下在所述时刻t1到所述时刻t2之间由所述支承物(19)发出的、作为时间的函数的光的量；以及步骤(92)，在该步骤由所述记录的光的量和由所述外推的光的量确定一组仅仅是由于所述试剂与ATP相接触而发出的、作为从所述时间t0开始的时间的函数的光的量的数值。
2.权利要求1的方法，其特征在于确定所述一组数值的所述步骤包括确定所述记录的光的量和所述外推的光的量之间的差值的步骤(92)。
3.权利要求1或2的方法，其特征在于在确定所述一组数据的步骤之后，检测步骤还包括对所述一组时间函数的数值进行积分的步骤(93)；以及将所述积分结果与预定数值进行比较以推断微生物的存在的步骤(94)。
4.权利要求1或2的方法，其特征在于在确定所述一组数值之后，检测步骤还包括选择所述一组数值的最大值的步骤；将所述选择的结果与预定数值进行比较以推断微生物的存在的步骤。
5.权利要求1-4任一项的方法，其特征在于所述检测步骤还包括区分假阳性的步骤，该步骤包括实施至少一个如下测试的步骤-证实在时刻t0之后所述支承物(19)发射的光的量随时间减少；-证实试剂沉积引起的光的突变的幅度大于预先确定的值；-证实相对于试剂沉积之前的光的量，在所述试剂沉积之后的预定时间，光的量仍然大于预先确定的值；-证实在所述试剂沉积之后，所述支承物(19)发射的光的量的减少不同于所述试剂沉积之前所述支承物发射的光的量的减少，和/或-证实所述支承物(19)发射的光的量大于预先确定的阈值的时间大于预定时间；在实施了至少一个上述测试的步骤之后，如果至少一个所述测试的结果是阴性的，表示存在假阳性的步骤。
6.权利要求1-5任一项的方法，其特征在于所述记录步骤包括-选择光电倍增器(50)的步骤；-将所述支承物(19)面对所述光电倍增器(50)放置的步骤；-在所述时刻t1打开置于所述光电倍增器(50)前面的关闭件(52)的步骤；-测量在所述时刻t1和所述时刻t2之间被所述光电倍增器(50)接收到的光的量的步骤；及-在存储器中存储所述测量结果的步骤。
7.权利要求1-6任一项的方法，其特征在于所述外推步骤如下进行计算对数函数系数，其作为时间的函数减少并根据未沉积所述试剂的所述支承物发射的光的量而变化。
8.权利要求1-7任一项的方法，其特征在于所述外推步骤基于在所述时刻t1和所述时刻t0之间记录的光的量。
9.权利要求1-8任一项的方法，其特征在于所述外推步骤基于在所述时刻t0+x和所述时刻t2之间记录的光的量，其中x是预定的期间。
10.权利要求1-9任一项的方法，其特征在于通过发光显示ATP存在的所述试剂是基于荧光素-荧光素酶的试剂。
11.权利要求1-10任一项的方法，其特征在于作用于所述微生物的所述步骤包括裂解所述微生物的步骤。
12.权利要求11的方法，其特征在于所述裂解步骤通过加热所述支承物(19)进行。
13.权利要求12的方法，其特征在于所述加热步骤包括将所述加热温度升高至从50℃至150℃的一个值的步骤。
14.权利要求13的方法，其特征在于所述加热步骤包括将所述加热温度升高至从70℃至100℃的一个值的步骤。
15.权利要求12-14任一项的方法，其特征在于所述支承物(19)通过微波加热。
16.权利要求1-10任一项的方法，其特征在于作用于所述微生物的所述步骤包括使所述微生物可透过的步骤。
17.权利要求16的方法，其特征在于所述使所述微生物可透过的步骤包括将适于使所述微生物可透过的试剂喷洒到所述支承物(19)上的步骤。
18.权利要求1-17任一项的方法，其特征在于所述支承物(19)是微孔膜。
全文摘要
本发明的方法包括如下步骤选择可以通过发光显示ATP存在的试剂、将所述试剂沉积在可以滞留微生物的支承物上及检测所述支承物对所述试剂的应答；所述检测步骤包括记录所述支承物发光量的步骤(90)，从进行所述沉积步骤的时刻t
文档编号G01N21/64GK101024854SQ20071000585
公开日2007年8月29日 申请日期2007年2月25日 优先权日2006年2月24日
发明者拉斐尔·格里尼翁, 克里斯蒂安·克洛斯, 马尔莱·普雷塞尔, 塞巴斯蒂安·里博 申请人:米利波尔公司