一种魔芋软腐病株根域土壤微生物群落结构分析方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种魔芋软腐病株根域土壤微生物群落结构分析方法，属于菌落研宄 分析领域。
【背景技术】
[0002] 软腐病是造成魔芋减产、品质下降最严重的细菌性种传和土传病害。引起魔芋软 腐病流行的原因复杂，其中土壤微生物区系异常是主要原因之一。董坤等分析了土壤微生 物数量与魔芋软腐病的相关性，发现土壤中细菌、镰刀菌及卵菌数量与软腐病发病率呈正 相关，放线菌数量与软腐病发病率呈负相关。但不清楚除软腐病菌外哪些微生物影响了魔 芋根系病害发生，尚无魔芋软腐病发病植株根域土壤微生物群落结构研宄报道。本文拟通 过对魔芋软腐病株与健株根域土壤微生物区系及土壤养分的系统比较研宄，探索魔芋软腐 病株根域土壤微生物群落结构特征，进而揭示魔芋软腐病发生的微生态机制，以期为利用 微生态调控技术防治魔芋软腐病提供科学依据。
[0003] 已有研宄表明，放射型根瘤菌能抑制植物病原细菌青枯雷尔氏菌、植物病原真菌 西瓜果斑病菌和棉花黄萎病大丽轮枝菌，也能促进甜瓜幼苗生长。苏云金芽孢杆菌是目前 世界上应用范围最广、效果最好的绿色环保型微生物杀虫剂，其胞内毒蛋白对一代二化螟 等多种害虫有杀灭作用。该菌数量多，可能通过减少魔芋根区、根表土壤害虫数量及害虫对 魔芋根系的侵害减轻了病原微生物的侵染，降低了软腐病的发病率。烟曲霉对烟草青枯病 原细菌前科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum)有稳定的诘抗作用，其次生代谢产物也具 有抗菌和抗肿瘤活性。纤维素链霉菌对番茄叶霉病有防治作用[34]。在魔芋健株根区、根 表土壤或根系中，以上4种优势菌大量存在可能与魔芋健康生长密切相关，为魔芋健康生 长时特有的土壤微生物群落结构。
[0004] 多年来，对魔芋软腐病的研宄及防治重点一直集中在软腐病原细菌，对其余有害 微生物重视不够。魔芋软腐病流行原因复杂，其中，连作导致田间有害微生物积累、土壤微 生物种群结构失衡是引起魔芋软腐病发生的一个重要原因。近年来，国内外学者在苹果、马 铃薯及黄瓜等作物土传病害发生与根际土壤微生物区系变化方面取得了重要的研宄成果， 但引起魔芋软腐病发生的土壤微生物群落结构改变研宄很少，有关魔芋软腐病发生的微生 态机制未见报道。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种魔芋软腐病株根域土壤微生 物群落结构分析方法，对魔芋软腐病发生的土壤微生物群落结构改变研宄，开辟了有关魔 芋软腐病发生的微生态机制研宄的先河，具有重大意义。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种魔芋软腐病株根域土壤微 生物群落结构分析方法，其创新点在于：具体包括以下步骤：
[0007] (1)采集并处理供试样品：在连作第4年的魔芋种植基地，采集农田中与玉米间作 的健康及典型软腐症状的魔芋全植株及其根外土壤、根区土壤、根表土壤及根系，样品采集 及处理参照现有方法进行；
[0008] (2)准备培养基：牛肉膏蛋白胨、马铃薯蔗糖及高氏1号培养基；
[0009] (3)微生物分离计数：稀释平板涂抹法分离计数微生物数量。细菌、真菌及放线菌 分别采用牛肉膏蛋白胨、马铃薯蔗糖及高氏1号琼脂培养基，均设3个稀释度，每个稀释度 重复3皿，28°C倒置培养，细菌2d，真菌3d，放线菌8d后计数，同时挑取优势菌纯化后于斜 面培养基保藏；
[0010] 芽孢细菌与荧光细菌数量：将细菌培养基上菌落呈蜡样光泽、皱褶，具有典型芽孢 杆菌特征的细菌菌落计数为芽孢菌；将细菌培养基上所有呈现荧光的菌落均计数为荧光细 菌；
[0011] 链霉菌属：将高氏1号培养基上具有典型链霉菌属菌落形态特征的放线菌计数为 链霉菌；
[0012] (4)优势菌株鉴定：采用酶解法分别提取细菌、放线菌总DNA，均采用细菌通用引 物PA、PB进行16SrRNA基因扩增；
[0013] 采用CTAB法提取真菌总DNA，rDNA-ITS扩增引物为真菌通用引物；将扩增产物进 行测序，采用BLAST方法和CLUSTALX2. 0软件将获得的序列与NCBI中高相似度序列进行同 源性比对，Mega5. 0软件中Neighbor-Joining法构建系统进化树；
[0014] (5) 土壤pH及养分测定：使用DELTA 320pH计测定土壤pH ;重铬酸钾氧化-外加 热法测定有机质含量；NH4-N含量采用2mol · PKCl浸提，流动分析仪测定；速效P含量采 用0· 5mol · 171似!10)3浸提，钼锑抗比色法测定；速效K含量采用Imol · LlMOAc浸提，火 焰光度法测定。
[0015] (6)数据处理：采用SPSS17. 0软件进行数据分析，Duncan法进行差异显著性检验， 病株以D表示，各项指标较健株的增率用ΛΗ%表示，健株以H表示，按公式一计算。供试样 品中某种优势细菌数量占该样品中细菌总数的比例用P%表示，按公式二计算；某种优势 真菌及放线菌所占比例计算与细菌相同；
【主权项】
1. 一种魔芋软腐病株根域土壤微生物群落结构分析方法，其特征在于：具体包括以下 步骤： (1) 采集并处理供试样品：在连作第4年的魔芋种植基地，采集农田中与玉米间作的健 康及典型软腐症状的魔芋全植株及其根外土壤、根区土壤、根表土壤及根系，样品采集及处 理参照现有方法进行； (2) 准备培养基：牛肉膏蛋白胨、马铃薯蔗糖及高氏1号培养基； (3) 微生物分离计数：稀释平板涂抹法分离计数微生物数量。细菌、真菌及放线菌分别 采用牛肉膏蛋白胨、马铃薯蔗糖及高氏1号琼脂培养基，均设3个稀释度，每个稀释度重复3 皿，28°C倒置培养，细菌2d，真菌3d，放线菌8d后计数，同时挑取优势菌纯化后于斜面培养 基保减； 芽孢细菌与荧光细菌数量：将细菌培养基上菌落呈蜡样光泽、皱褶，具有典型芽孢杆菌 特征的细菌菌落计数为芽孢菌；将细菌培养基上所有呈现荧光的菌落均计数为荧光细菌； 链霉菌属：将高氏1号培养基上具有典型链霉菌属菌落形态特征的放线菌计数为链霉 菌； (4) 优势菌株鉴定：采用酶解法分别提取细菌、放线菌总DNA，均采用细菌通用引物PA、 PB进行16SrRNA基因扩增； 采用CTAB法提取真菌总DNA，rDNA-ITS扩增引物为真菌通用引物；将扩增产物进行测 序，采用BLAST方法和CLUSTALX2. 0软件将获得的序列与NCBI中高相似度序列进行同源性 比对，Mega5. 0软件中Neighbor-Joining法构建系统进化树； (5) 土壤pH及养分测定：使用DELTA320pH计测定土壤pH;重铬酸钾氧化-外加热 法测定有机质含量；NH4-N含量采用2mol?PKCl浸提，流动分析仪测定；速效P含量采用 0? 5mol? 171似110)3浸提，钼锑抗比色法测定；速效K含量采用lmol?LiMOAc浸提，火焰 光度法测定。 (6) 数据处理：采用SPSS17. 0软件进行数据分析，Duncan法进行差异显著性检验，病株 以D表示，各项指标较健株的增率用AH%表示，健株以H表示，按公式一计算。供试样品中 某种优势细菌数量占该样品中细菌总数的比例用P%表示，按公式二计算；某种优势真菌 及放线菌所占比例计算与细菌相同；
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2. 根据权利要求1所述的魔芋软腐病株根域土壤微生物群落结构分析方法，其特征在 于：所述步骤（4)中的PA、PB的通用核苷酸序列分别如下： PA:5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ； PB:5' -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。
3. 根据权利要求1所述的魔芋软腐病株根域土壤微生物群落结构分析方法，其特征在 于：所述步骤（4)中真菌通用引物发核苷酸序列如下： ITS1 :5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' ；
【专利摘要】本发明公开了一种魔芋软腐病株根域土壤微生物群落结构分析方法，包括采集并处理供试样品、准备培养基微生物分离计数、优势菌株鉴定、土壤pH及养分测定、数据处理；本发明的魔芋软腐病株根域土壤微生物群落结构分析方法，对魔芋软腐病发生的土壤微生物群落结构改变研究，开辟了有关魔芋软腐病发生的微生态机制研究的先河，具有重大意义。通过本发明的魔芋软腐病株根域土壤微生物群落结构分析方法的研究，发现在魔芋软腐病株根域，有9种优势微生物大量存在：3种优势细菌为变形假单胞菌、绿针假单胞菌致金色亚种及寡养食单胞菌；4种优势真菌为腐皮镰刀菌、尖孢镰刀菌、变灰青霉及青霉；2种优势放线菌为疮疥链霉菌、淀粉酶产色链霉菌。
【IPC分类】C12Q1-68, C12Q1-04
【公开号】CN104611432
【申请号】CN201510040846
【发明人】张忠良, 何斐, 薛泉宏
【申请人】西北农林科技大学
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年1月27日