一种检测纤维蛋白原snp的试剂盒及其方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种检测纤维蛋白原SNP的试剂盒，本 发明尤其涉及一种检测纤维蛋白原AaThr312Ala(A/G)SNP的试剂盒，本发明还涉及一种 检测纤维蛋白原SNP的方法。
【背景技术】
[0002] 慢性血栓栓塞性肺动脉高压（chronic thromboembolic pulmonary hypertension, CTEPH)是指一次或反复发生的血栓栓塞导致血栓机化、肺血管管腔狭窄甚 至闭塞，长期不能缓解，导致肺血管阻力增加，肺动脉压力进行性增高，最终导致右心室肥 厚和右心衰竭的综合征。目前报道，肺血栓栓塞症（pulmonary thromboembolism, PTE)后 继发CTEPH的比率为0. 5-8. 8%，估测发病率至少在4%。我国PTE的发病率约为0. 23%， 即我国至少有300万PTE患者，因此我国约有12万左右的CTEPH患者。CTEPH病死率极高， 有报道称，在平均肺动脉压（mean pulmonary arterial pressure, mPAP)>50mmHg 的 CTEPH 患者，其5年生存率不足14%。也有人报道，若mPAP>50mmHg，则5年生存率约10 %，危害超 过多种恶性肿瘤。
[0003] 多数研究结果提示PTE患者体内的血栓未能及时溶解而持续存在，最终导致了 CTEPH的发生。血栓形成的底物及血栓主要成分的来源均为纤维蛋白原，因此纤维蛋白原基 因或表达的异常等均可影响血栓的溶解。我们课题组通过病例对照研究，发现纤维蛋白原 A a Thr312Ala (A/G)此SNP位点与CTEPH的发病密切相关，该研究已于2013年发表于Plos One杂志。这为早期发现CTEPH提供了一个重要的分子标记物。
[0004] 目前检测SNP的技术有"金标准"--测序法、大批量的基因芯片法以及传统的 限制性片度长度多态性（restriction fragment length polymorphism, RFLP)的方法。测 序法最为准确，但费用过高而不宜广泛应用于患者的常规临床检测。大批量的基因芯片法 因位点的不同而难于一起检测，且因 CTEPH临床检测的标本数相对较少而容易造成如下后 果：或者浪费芯片而造成费用过高，或者浪费时间而造成患者等待检测结果的时间过长。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种检测纤维蛋白原SNP的试剂盒，解决了现有技术中存在 的费用过高或耗时过长的问题。
[0006] 本发明所采用的第一技术方案是，一种检测纤维蛋白原SNP的试剂盒，包括 2.500μ 1的10XDNA聚合酶缓冲液，2.000μ 1的dNTP混合物，0. 125μ 1的DNA聚合酶， 1.000 μ 1的上游引物，1.000 μ 1的下游引物，LOug的基因组模板DNA，ly 1的Scal，2 μ 1 的Seal buffer，lyl的DNA上样缓冲液；其中，上游引物为5'cag agt gga agg cattaa cag a 3' ；下游引物为 5' gggttttgg ttt cca gta ctt c 3'。
[0007] 本发明所采用的第二技术方案是，一种检测纤维蛋白原SNP的方法，具体按照以 下步骤实施：
[0008] 步骤1、基因组DNA提取：用购自天根生物技术有限公司的基因组DNA提取试剂 盒，从0. 75ml人体血细胞中提取基因组DNA ;
[0009] 步骤2、利用步骤1中提取的基因组DNA为模板进行特异性PCR扩增；
[0010] 步骤3、将酶切产物进行琼脂糖凝胶中电泳，对基因型进行判定。
[0011] 本发明的特点还在于，
[0012] 步骤2中PCR体系为2. 500 μ 1的10XDNA聚合酶缓冲液、2. 000 μ 1的dNTP混合 物、0. 125μ 1的DNA聚合酶、Ι.ΟΟΟμ 1的上游引物、1.000的下游引物、LOug的基因组模板 DNA，补充去离子水至25. 000 μ 1。
[0013] 步骤2中25. 000μ I PCR体系的程序设定如下：94 °C 5min ; 94°C 40s - 52°C 40s - 72°C 40s，25 个循环；72°C 10min。
[0014] 步骤2中使用的特异性引物为上游引物和下游引物，由Sigma公司合成，序列如 下所示：上游引物 5' cag agt gga agg cat taa cag a 3' ；下游引物 5' ggg ttt tgg ttt cca gta ctt c 〇
[0015] 步骤3在酶切体系中进行，所述25. 000 μ 1的酶切体系为：20 μ 1的PCR产物、1 μ 1 的 Scal、2 μ 1 的 Seal buffer、补去离子水至 25. 000 μ 1。
[0016] 所述步骤3中所述的酶切产物的酶切位点如下：5' AGT，ACT3，，3, TCA，TGA5，，序 列中间的单引号表示酶切位点；根据上述酶切位点脱氧核糖核苷酸是野生型A还是突变型 T对基因型进行判定：
[0017] 如果酶切产物为176bp、78bp及39bp三种片段，显示检测个体基因型为AA基因 型，为野生型纯合体，电泳结果为三条带；
[0018] 如果酶切产物为176bp、117bp、78bp及39bp四种片段，显示检测个体基因型为AG 基因型，为杂合体，电泳结果为四条带；
[0019] 如果酶切产物为176bp及117bp两种片段，显示检测个体基因型为GG基因型，为 突变型纯合体，电泳结果为两条带。
[0020] 本发明的有益效果是：本发明的试剂盒和应用是基于RFLP的原理，通过设计恰当 的引物，利用传统的PCR及酶切的方法，通过普通凝胶电泳读取不同大小的条带判读结果。 操作方法简单易行，结果易于解读，质优价廉，便于临床开展小规模的临床检测。本试剂盒 所用方法简单，结果可靠，价格便宜，检测出的SNP与慢性血栓栓塞性肺动脉高压具有非常 高的关联性。
【附图说明】
[0021] 图1是该方法检测的SNP结果图；
[0022] 图2是测序法验证该检测方法与金标准的结果对比图。
【具体实施方式】
[0023] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0024] 本发明提供一种检测纤维蛋白原A a Thr312Ala SNP的PCR试剂盒，该试剂盒的组 分和含量分别是：用于PCR的试剂：10XDNA聚合酶缓冲液、dNTP混合物、DNA聚合酶（均 购自大连宝生物公司），引物、模板DNA及去离子水；用于酶切的试剂：Seal、Seal缓冲液 (购自New England BioLabs公司）；用于产物鉴定的DNA上样缓冲液（购自New England BioLabs 公司）。
[0025] 实施例1
[0026] 检测纤维蛋白原A a Thr312Ala SNP的方法的建立。
[0027] 1)基因组DNA提取：用购自天根生物技术有限公司的基因组DNA提取试剂盒，从 0. 75ml血细胞中提取基因组DNA。
[0028] 2)特异性PCR扩增
[0029] 利用步骤1中提取的基因组DNA为模板进行特异性PCR扩增；
[0030] PCR扩增反应使用的合成引物，由Sigma公司合成，序列如下：5'引物（上游引物， 序列如 SEQ ID No. 1 所示）5' cag agt gga agg cattaa cag a 3' ；3' 引物（下游引物，序 列如SEQIDNo·2所不）：5，gggttttggtttccagtacttc3，。
[0031] PCR扩增反应体系，其中PCR反应体系如下（DNA聚合酶、IOXDNA聚合酶缓冲液、 dNTP混合物）：
[0032]
【主权项】
1. 一种检测纤维蛋白原SNP的试剂盒，其特征在于，包括2. 500 ill的10XDNA聚合酶 缓冲液，2. 000 ill的dNTP混合物，0. 125 ill的DNA聚合酶，1. 000 ill的上游引物，1. 000 ill 的下游引物，1. 〇ug的基因组模板DNA，1 ill的Scal，2iil的Seal buffer，1 ill的DNA上样 缓冲液；其中，上游引物为5'cag agt gga agg cat taa cag a 3';下游引物为5'ggg ttt tgg ttt cca gta ett c
2. -种检测纤维蛋白原SNP的方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施： 步骤1、基因组DNA提取：用购自天根生物技术有限公司的基因组DNA提取试剂盒，从 0. 75ml人体血细胞中提取基因组DNA ; 步骤2、利用步骤1中提取的基因组DNA为模板进行特异性PCR扩增； 步骤3、将酶切产物进行琼脂糖凝胶中电泳，对基因型进行判定。
3. 根据权利要求2所述的检测纤维蛋白原SNP的试剂盒的方法，其特征在于，所述步骤 2中PCR体系为2. 500 ill的10XDNA聚合酶缓冲液、2. 000 ill的dNTP混合物、0. 125 ill的 DNA聚合酶、1.000 ill的上游引物、1.000 ill的下游引物、l.Oug的基因组模板DNA，补充去 离子水至25. 000 u 1。
4. 根据权利要求3所述的检测纤维蛋白原SNP的试剂盒的方法，其特征在于，所述步骤 2 中 25. 000 ii 1 PCR 体系的程序设定如下：94°C 5min ;94°C 40s - 52°C 40s - 72°C 40s，25 个循环；72°C lOmin。
5. 根据权利要求2所述的检测纤维蛋白原SNP的试剂盒的方法，其特征在于，所述步 骤2中使用的特异性引物为上游引物和下游引物，由Sigma公司合成，序列如下所示：上游 弓丨物 5, cag agt gga agg cat taa cag a 3,；下游弓|物 5, ggg ttt tgg ttt cca gta ett c 3，。
6. 根据权利要求2所述的检测纤维蛋白原SNP的试剂盒的方法，其特征在于，所述步骤 3在酶切体系中进行，所述25. OOOiil的酶切体系为：20iil的PCR产物、liil的Scal、2iil 的Seal buffer、补去离子水至25. 000 ul。
7. 根据权利要求2所述的检测纤维蛋白原SNP的试剂盒的方法，其特征在于，所述步 骤3中所述的酶切产物的酶切位点如下：5'AGT，ACT3，，3,TCA' TGA5'，序列中间的单引号 表示酶切位点；根据上述酶切位点脱氧核糖核苷酸是野生型A还是突变型T对基因型进行 判定： 如果酶切产物为176bp、78bp及39bp三种片段，显示检测个体基因型为AA基因型，为 野生型纯合体，电泳结果为三条带； 如果酶切产物为176bp、117bp、78bp及39bp四种片段，显示检测个体基因型为AG基因 型，为杂合体，电泳结果为四条带； 如果酶切产物为176bp及117bp两种片段，显示检测个体基因型为GG基因型，为突变 型纯合体，电泳结果为两条带。
【专利摘要】本发明提供一种检测纤维蛋白原SNP的试剂盒，包括2.500μl的10×DNA聚合酶缓冲液，2.000μl的dNTP混合物，0.125μl的DNA聚合酶，1.000μl的上游引物，1.000μl的下游引物，1.0ug的基因组模板DNA，1μl的ScaI，2μl的ScaI buffer，1μl的DNA buffer。本发明还提供一种检测纤维蛋白原SNP的方法，操作方法简单易行，结果易于解读，质优价廉，便于临床开展小规模的临床检测。本试剂盒所用方法简单，结果可靠，价格便宜，检测出的SNP与慢性血栓栓塞性肺动脉高压具有非常高的关联性。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104611431
【申请号】CN201510036682
【发明人】李积凤, 王辰, 王军, 杨媛华, 翟振国, 梁燕, 张云霞
【申请人】首都医科大学附属北京朝阳医院
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年1月26日