一种溶纤维蛋白乳酸菌豆豉的快速生产方法
【技术领域】
[0001]本发明属于食品发酵工程领域，具体涉及一种以黄豆为基质，采用生物工程发酵技术，生产溶纤维蛋白、补充人体益生乳酸菌的功能性豆豉快速生产方法。
【背景技术】
[0002]近年来，脑血栓、动脉粥样硬化等心血管疾病已成为威胁人类健康的元凶，在中国，血栓性疾病对人们健康造成的损害已经超过癌症和糖尿病。血栓的主要成分是纤维蛋白，治疗血栓性疾病副作用较小的方法是采用纤溶酶或其激活剂。此外，随着生活节奏加快，生活饮食不规律造成的肠道微生态环境紊乱，由此而引发的其他疾病也越来越严重。人们生活水平的提高、保健意识的增强，对药食同源、天然健康的功能性保健食品的需求强烈。
[0003]豆豉是中国的传统黄豆发酵食品之一，深受普通百姓喜爱，是餐桌上必不可少的佐餐食品；它不仅风味独特、营养丰富，而且富含多种生理活性物质，具有开胃增食、消积化滞、驱风散寒及预防心脑血管疾病等生理保健机能。但豆豉在我国的消费方式仅限于调味品、且生产方式大多以自然发酵为主，受季节限制、规模化程度不高，产品质量不稳定。
[0004]研究人员从韩国传统黄豆发酵食品Chung kook-Jang和Doen-Jang中分离纯化得到纤溶酶CK和Subtilisin DJ-4 ;从我国发酵豆豉中分离得到具有溶栓作用的豆豉纤溶酶以及从台湾黄豆发酵食品中发现的纤溶酶原；从印尼的发酵丹贝(Tempe)中而分离得到一种少孢根霉产生的天培激酶(Tempe kinase)及日本纳豆中所存在的枯草芽孢杆菌分泌产生的纳豆激酶均具有较好的溶栓效果，它们不仅溶栓作用强，而且无任何毒副作用，不会引起内出血。它们不但半衰期长，生产成本明显较低，而且可通过胃肠道屏障。
【发明内容】
[0005]本发明为了解决现有豆豉发酵技术存在的缺陷，提供了一种溶纤维蛋白乳酸菌豆豉的快速生产方法，该方法采用生物工程发酵技术，结合传统豆豉生产工艺，以黄豆为原料，接种自主筛选的枯草芽孢杆菌，经过前发酵得豆豉半成品，随后接种自主筛选的乳酸菌，4°C后发酵72h。并开发一种溶血栓、补充人体肠道菌群平衡的功能性保健食品，开创一种大豆深加工的新技术，本发明通过如下技术方案实现:
一种溶纤维蛋白乳酸菌豆豉的快速生产方法，包括如下步骤:
(I)黄豆预处理
A、挑选除杂:选用颗粒饱满、肉多、粒径大小基本一致；无霉变、无虫蛀、充分成熟，表皮无皱、有光泽的黄豆，剔除杂质；
B、浸泡:称取挑选除杂的黄豆，清洗后，黄豆与水的比例为l:2-3，25-30°C温水浸泡6-9h，浸泡程度以豆粒表面将涨未涨满状，即皮皱未完全舒展为宜；
C、蒸煮:将水倒出，沥干多余水分，放入玻璃容器中，蒙上纱布，110-121 °C蒸煮8-15mins，蒸煮使黄豆熟而未过，手捏豆粒，豆粒柔软，豆皮能用手搓破； (2)黄豆前发酵(枯草芽孢杆菌发酵)
待蒸煮后的黄豆冷却至40±2°C后，将扩大培养的也ciWM subtilis SYL-1菌株培养液，4°C、8000rpm离心5_8mins，菌体沉淀用50ml生理盐水溶解，然后接种于冷却至40±2°C蒸煮后的黄豆中，搅拌均匀，26-32°C发酵42-54h ;
(3)黄豆后发酵(乳酸菌发酵)
将扩大培赛饱 Lactobacillus brevis SYL-2 菌株培养液，4°C、4000rpm、离心 4_6mins，弃上清液，菌体沉淀用50ml生理盐水溶解，然后接种于豆豉半成品中，搅拌均匀，32-37°C发酵42-54h ;发酵完毕放入4°C冰箱中后发酵72h，即得成品豆豉。
[0006](4)枯草芽孢杆菌种子液的制备
A、黄豆前发酵枯草芽孢杆菌的获取，从云南传统发酵豆豉中筛选得到高产豆豉纤溶酶菌株 JiAS sub tills SYL-1，于 _80°C 冰箱中保存；
B、培养基配制:普通肉汤22g，IL去离子水溶解，121°C高压灭菌15mins，冷却后4°C冰箱保存；
C、菌株复壮:将保存的subtilisSYL-1菌株从_80°C冰箱中取出，解冻后，取60 μ L接种至5mL的灭菌新鲜营养肉汤培养基中，140_180rpm，37°C摇床培养42_54h ;
D、种子液制备:按3-5%的接种量，取1.5mL菌液接种至50mL的灭菌新鲜营养肉汤培养基中，140-180rpm、37°C摇床培养 42_54h。
[0007](5)乳酸菌种子液的制备
A、黄豆后发酵乳酸菌的获取，从云南传统发酵豆豉中筛选得到LactobacillusbrevisSYL-2，于-80 °C冰箱中保存；
B、MRS肉汤培养基配制:称取蛋白胨 10.0g、Lab_lemco’ powder 8.0g、Yeast extract4.0g、Glucose 20.0g/L、Tween-80 lmL、磷酸氢二钾 2.0g、醋酸钠 5.0g、柠檬酸三铵 2.0g、七水硫酸镁0.2g、四水硫酸锰0.05g，IL去离子水溶解配置成pH6.2的培养基，121°C高压灭菌15mins，冷却后4°C冰箱保存；
C、菌株复壮:将保存的Lactobacillusbrevis SYL-2菌株从_80°C冰箱中取出，解冻后，取30 μ L接种至5mL的灭菌MRS肉汤培养基中，置于37°C恒温培养箱，静置培养48h ;
D、种子液的制备:复壮菌株培养48h后，按2-3%的接种量，取1.0mL菌液接种至50mL灭菌MRS肉汤培养基中，37 °C静置培养42-54h。
[0008]有益效果:
本发明与现有技术相比，具有明显的优势:突破传统豆豉自然发酵方法，采用两级固态发酵，接种枯草芽孢杆菌发酵进行前发酵，枯草芽孢杆菌分泌大量的酶，分泌的蛋白酶作用于黄豆中的蛋白质，使其部分水解，水溶性氮含量提高，黄豆硬度下降，此时，蛋白酶更易与蛋白质接触，水解产生一系列胨、多肽、氨基酸，有利于人体的吸收，也有利于后来接种的乳酸菌生长；淀粉酶使原料豆中的淀粉水解为单糖等，枯草芽孢杆菌分泌的豆豉纤溶酶，能强烈溶解纤维蛋白；在此基础上，接种乳酸菌进行后发酵，使豆豉中的有机酸、多肽、氨基酸及酯类物质等风味成分增加。
[0009]经过两级固态发酵，豆豉中含有乳酸菌和枯草杆菌，这两种活菌是健康人肠道中的正常菌群成员。枯草芽孢杆菌分泌产生的枯草菌素、短杆菌肽等活性物质，能明显抑制致病菌的生长，减少肠源性毒素的产生和吸收，有效地保护肠道健康；消耗肠道中的游离氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道PH值，间接抑制其它致病菌生长；合成分泌α -淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多种酶类，促进肠道对营养物质的消化、吸收，增强肠道功能。另一方面能合成维生素BpBpB6、烟酸等多种B族维生素，提高机体内干扰素和巨噬细胞的活性。乳酸菌是国际公认的食品安全级微生物，除具有天然防腐功能、改善食品风味、增强营养等功能，还具有维持宿主肠道菌群平衡，防止肠道致病菌感染及预防心脑血管疾病等生理功能。
[0010]经过枯草芽孢杆菌的前发酵和乳酸菌的后发酵，豆豉中的营养成分和功能成分均显著增加，可开发成为抗氧化、抗血栓、预防心血管疾病、维护肠道菌群平衡的新一代豆豉保健食品，具有显著的社会效益和经济效益。
【具体实施方式】
[0011]下面结合实施例来对本发明的具体实施步骤作详细阐述。
[0012]实施例1:
1、黄豆前处理
Α.选用颗粒饱满、肉多、粒径大小基本一致；无霉变、无虫蛀、充分成熟，表皮无皱、有光泽的黄豆，剔除杂质；
B、称取Ikg黄豆，清洗后，黄豆与水的比例为1:2.5，30°C温水浸泡8h，浸泡程度以豆粒表面将涨未涨满状，即皮皱未完全舒展为宜；
C、将水倒出，沥干多余水分，放入玻璃容器中，蒙上四层纱布，于高压灭菌锅114°C蒸煮15mins，蒸煮使黄豆熟而未过，手捏豆粒，豆粒柔软，豆皮能用手搓破。
[0013]2、黄豆前发酵(枯草芽孢杆菌发酵)
(1)黄豆前发酵菌株枯草芽孢杆菌发酵的获取，从云南传统发酵豆豉中筛选得到高产豆鼓纤溶酶菌株SYL-1 Bacillus于_80°C冰箱中保存；
(2)菌株复壮:将保存的实验菌株从-800C冰箱中取出，解冻后，取60μ L接种至5mL的灭菌新鲜营养肉汤培养基中，150rpm，37 °C摇床培养48h ;
(3)种子液制备:按3%的接种量，取1.5mL菌液接种至50mL的灭菌新鲜营养肉汤培养基中，150rpm，37°C摇床培养48h。
[0014](4)待蒸煮后的黄豆冷却至40±2°C后，将扩大培养的sub tills SYL-1菌株培养液，4°C、8000rpm、离心8mins，弃上清液，菌体沉淀用50ml生理盐水溶解，然后接种于冷却至40±2°C蒸煮后的黄豆中，搅拌均匀，28°C发酵36h，得豆豉半成品；
3、黄豆后发酵(乳酸菌发酵)
(1)黄豆后发酵乳酸菌菌株获取，从云南传统发酵豆豉中筛选得到，SYL-2Lactobacillus Are [is，于-80 °C 冰箱中保存；
(2)菌株复壮:将保存的SYL-2Lactobacillus AreKis菌株从_80°C冰箱中取出，解冻后，取30 μ L接种至5mL灭菌新鲜MRS肉汤培养基中，置于37°C二氧化碳培养箱中，静置培养 48h ；
(3)种子液制备:按2%的接种量，取1.0mL菌液接种至50mL灭菌的新鲜的MRS肉汤培养基中，37 °C静置培养48h ；
(4 )将扩大培养的 Lac tobacillus bre vis SYL-2 菌株培养液，4 °C、4000rpm、离心6mins，弃上清液，菌体沉淀用50ml生理盐水溶解，然后接种于豆豉半成品中，搅拌均匀，37°C发酵48h ;发酵完毕放入4°C冰箱中后发酵72h，即得成品豆豉。
[0015]4、豆豉纤溶酶活性、乳酸菌活菌数、感官评价
取后发酵72h的豆豉成品，采用纤维蛋白平板法测定豆豉纤溶酶活性，纤溶圈直径为(2.97+0.32) cm 'Lactobacillus AreKis活菌数为(5.62+0.13) 10 10CFU/g ;豆鼓外观较好、豉香味浓郁、有拉丝物质、酸度适宜，总体接受层度较好。
[0016]实施例2:
1、黄豆前