专利名称：：利用荧光标记酶切基因进行微生物群落结构分析的方法
技术领域：
：本发明涉及一种生物
技术领域：
的分析方法，具体是一种利用荧光标记酶切基因进行微生物群落结构分析的方法。
背景技术：
：微生物是地球上为数最为众多的一类生物，通常以复杂群落的形式存在，并在维系生态平衡、提供自然资源、调节宿主新陈代谢等方面发挥着重要的作用。目前，已有大量微生物被分离、培养和鉴定。但是由于培养方法有着费时费力的缺点以及技术上的局限性，近年来已有大量分子生物学方法被开发并应用于研究复杂微生物群落的结构，并对研究其功能提供指导。常用的微生物分子生物学技术包括基于分子标签(如SSUrRNA基因、ITS序列等)的分子指纹图谱技术，如变性/温度梯度凝胶电泳(DGGE/TGGE)、单链构像多态性(SSCP)、rDNA限制性片段多态性(ADRDA)、末端限制性酶切片段长度多态性(T-RFLP)等；以及用于全面描述微生物群落结构和物种进化关系的克隆文库分析等。DNA指纹图技术能够把从环境样品中PCR扩增得到的微生物群落中所有种群的特征性基因片段以指纹图谱的形式展现出来，从而快速灵敏地检测微生态系统的动态变化，展现微生物群落结构的多样性。ADRDA和T-RFLP是两种目前最常用的基于限制性酶切的DNA指纹图谱技术。ARDRA技术是通过PCR得到rDNA的基因序列混合物，用限制性内切酶进行消化，并通过凝胶电泳获得图谱，对得到的所有限制性片段多样性进行全面分析。但基于传统凝胶电泳技术使得其具有分辨率低、重复性差以及不便于数据统计分析等缺点，故目前多用于对环境中分离得到的菌株进行属、种水平的分类和菌株的区分，以及对rDNA克隆文库中的克隆进行分型和评价，仅有少数研究将其运用于分析废水、土壤等微生物群落结构；T-RFLP技术使用5'端用荧光标记的引物来扩3增目标基因，进行限制性酶切得到酶切片段，然后用DNA测序仪对带有荧光的末端限制性片段进行检测，从而获得代表微生物群落结构多样性的指纹图谱。依赖于毛细管电泳技术的T-RFLP技术具有高灵敏度，高通量及高重复性的优点，且便于多样性图谱的数字化输出和后续分析，故被广泛应用于包括土壤、水体、特殊地质层、生物降解池以及人和动物的肠道菌群在内的各种环境中微生物群落结构的比较分析和动态监测。但因其只对基因的末端限制性片段进行分析，故在对复杂微生物群落进行分析的时候具有一定的局限性。它仅检测末端限制性片段长度的多态性，因而在图谱中，同样长度的末端限制性片段可能来自几种不同的细菌，有的在进化关系中甚至相去甚远。同时，自然环境中的微生物群落多样性往往过于复杂，故T-RFLP图谱所反映的群落组成很难具体到种属水平，因此，在低分类单元水平上的多样性无法体现出来，但这种多样性恰恰是很多复杂样品的特征。运用多种限制性内切酶对同一样品进行检测，并将数据综合进行分析，可以得到微生物群落组成的更丰富的信息，这一手段已被广泛运用于弥补上述不足。但是，运用多种酶切不但费时费力，而且在数据处理的过程中容易引入误差。因此，结合上述两种方法的优点，发展一种能够准确和全面地对微生物群落结构进行分析的方法，具有重要的意义。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的局限，提供一种利用荧光标记酶切基因进行微生物群落结构分析的方法。本发明的方法利用了毛细管电泳的高通量、高灵敏度和高重复性等优点，能够有效获得全面的微生物群落结构信息。本发明是通过以下技术方案实现的，具体步骤如下步骤一，提取样本的基因组总DNA，扩增微生物系统发育标记基因；步骤二，利用限制性内切酶对扩增得到的标记基因进行酶切，得到带有粘性末端的限制性片段；步骤三，对所有限制性片段进行末端荧光标记；步骤四，运用DNA遗传分析仪分离并检测已被末端荧光标记的限制性片段，4得到样本的微生物组成信息图谱；步骤五，对信息图谱进行多元变量统计学分析，获得微生物群落结构信息特征与变化规律。步骤二中，所述酶切具体为，采用4核苷酸识别位点的限制性内切酶对标记基因进行酶切，获得具有粘性末端的酶切片段。步骤三中，所述末端荧光标记具体为，使用DNApolymeraseKlenow酶进行荧光标记，标记所用的底物是与酶切后得到的粘性末端碱基互补配对的脱氧单核苷酸。步骤四中，所述分离并检测具体为，利用DNA遗传分析仪进行检测。步骤五中，所述多元变量统计学分析为主成分分析。本发明涉及的是一种分析微生物群落结构的DNA指纹图谱方法，具体是选取具有微生物分类特征的特定基因片段作为研究对象，使用限制性内切酶对其进行酶切，并对所有的限制性片段进行荧光标记，通过DNA片段荧光分析仪器对所有片段进行检测和分析获得DNA多样性指纹图谱，用于比较研究多样本的微生物群落的结构。本发明具有如下的有益效果本发明的方法利用了毛细管电泳的高通量、高灵敏度和高重复性等优点，能够有效全面地获得微生物群落结构信息。图1DNA样品以ADRDA和本发明方法分析结果的比较；图2第一组模拟微生物群落用本发明方法分析的结果；图3第二组模拟微生物群落用本发明方法分析的结果；图4动物肠道微生物群落用本发明方法和T-RFLP法分析结果的比较。具体实施例方式下面对本发明的实施例做详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1下面通过对模拟微生物群落进行分析来进一步描述本发明1、16SrRNA基因代表序列的选取本实施例提取样品的基因组总DNA，并选取16SrRNA基因(或其它微生物系统发育标记基因，如gyrB、r叩B等)作为细菌多样性的标记基因，采用合适的通用引物扩增该标记基因片段。其中16SrRNA基因是目前分子生态学中最常用的系统进化标记基因，包含丰富的进化信息，且具有强大的数据库作为后续分析的支撑。本实例以16SrRNA基因为代表。本实施例所选取的16SrRNA基因代表序列选自李旻等人报道的中国人肠道菌群中的代表序列，共12条序列，记为A~F和H~M，其中5条来自拟杆菌门，4条来自厚壁菌门，3条来自变形菌门。该12条序列的Genbank登录号依次为EF403826,EF403827,EF403833,EF403836,EF403840,EF403957,EF404131,EF404244，EF404279，EF404297，EF404313，EF404522;同时这12条序列已经在《LiM，WangB,ZhangM，RantalainenM，WangS，ZhouH，ZhangY，ShenJ，PangX,ZhangM,WeiH，ChenY,LuH，ZuoJ，SuM，QiuY，JiaW，XiaoC，SmithLM，YangS，HolmesE，TangH，ZhaoG，NicholsonJK，LiL，ZhaoL.Symbioticgutmicrobesmodulatehumanmetabolicphenotypes.ProcNatlAcadSciUSA.2008Feb12;105(6):2117-22》(共生调节的人体肠道微生物的代谢表型，美国科学院院报)中公开。将这些序列克隆在常规TA克隆载体pGEMT质粒上，记为PAPF，PHPM。具体方法为将携带有质粒的E.coliDH5a细胞于LB培养基中培养后，用试剂盒抽取质粒DNA作为以下研究对象。2、对单序列进行片段分析将质粒DNA以16SrRNA基因全长通用引物27f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492r(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT)进行PCR扩增。采用具有4核苷酸识别位点的限制性内切酶Mspl(5'-C—CGG)对16SrRNA基因扩增产物进行酶切，得到带有粘性末端的限制性片段，这些片段可作为样品的微生物群落多样性的指标，当一个样品的多样性较高时可能会产生更多种类的酶切片段；产生粘性末端保证了后续标记步骤的进行。在Klenow酶的作用下，将荧光标记的Cy5-dCTP(或其它与酶切片段粘性末端核苷酸碱基互补的荧光标记脱氧三磷酸核苷酸)通过碱基互补连接到粘性末端，使DNA片段进行荧光标记。运用BeckmanCEQ8000DNA遗传分析仪(或其它可对荧光标记的DNA片段进行分离和片段大小测定的仪器)分离检测经酶切和荧光标记的限制性片段，得到DNA片段大小和丰度组成的信息图谱。对前述12条序列用本方法进行分析；同时根据这12条16SrRNA基因的序列信息和内切酶M印I的酶切位点(5'-(TCGG)对生成片段进行模拟，得到相应限制性片段的数量和长度的理论值；并对这12条序列进行ARDRA分析。将实验得到的片段信息与模拟结果、ARDRA分析结果作比较。根据模拟酶切，所有片段都位于0~800bp区间内。考虑到测序仪本身的检测局限，以及去除引物二聚体的影响，本实施例选取70~600bp区间内的片段，比较模拟结果与实验结果得知，在模拟中出现的该区间的69个片段全都能够被检测到，来自各代表序列的片段数目与模拟值一致。ARDRA分析得到片段数目也与本方法检测结果一致(图la)。图1为DNA样品以ADRM和本实施例分析结果的比较图，图中，a单条16SrRNA基因片段样本，b动物肠道微生物群落DNA样本。作为比ARDRA更精细的检测方法，本实施例能够较为准确地测量出片段的长度。经比较发现，片段长度的测量值与模拟值的结果一致。来自不同序列的模拟长度相同的片段，其长度测量值的差别不超过lbp;对于长度在100bp以上的片段，62。/。的片段其测量值与模拟值之间的误差为土lbp以内，92。/。为土2bp以内。而在长度在100bp以内的片段，误差范围较大，仅有42%的片段其测量值与模拟值之间的误差为土2bp以内。基于此，为了减小检测误差，准确表现群落结构，本实施例100~600bp范围内的片段信息是准确可靠的，并在后面的分析中，选取本区间的片段用于数据分析。73、构建模拟微生物群落并对结构进行分析用前述含有单条序列的质粒构建两组模拟微生物群落。第一组由PA和PE组成，编号为P1P8八个组合，其构建方法是向lOOng质粒PE中依次加入质粒PA，其质量为10ng，5ng，2ng，1.25ng，lng，0.5ng，0.2ng，0.lng，换算成质粒拷贝数即为向拷贝数为4.13*10w的质粒PE中依次加入拷贝数为4.13*109，2.08*109，8.26*108，5.17*108，4.13*108，2.08*108，8.26*107，4.13*107的质粒PA，其中质粒PA所占百分比依次为9.09%，4.76%，1.96%，1.23%，0.99%，0.50%，0.20%，0.10%，比例依次减小；第二组由质粒PA，PB，PE，PF，PL按照不同比例混合构建，记为M1M5，共五个模拟群落组合，具体组成见表l。用本实施例前述单个质粒分析实验步骤检测两组模拟微生物群落结构，得到模拟微生物群落DNA酶切片段的长度和丰度值。根据模拟群落中16SrRNA基因序列信息和酶切位点对生成片段进行模拟，得到相应限制性片段的数量和长度的理论值，并与实际检测结果作比较；以来自同一质粒的片段的平均丰度来表示该质粒在群落中含量的检测值，计算其在混合群落中的比例，并将其与各质粒的实际比例进行比较，从而确定本实施例对微生物群落结构组成分析的准确性。表l各质粒在模拟微生物群落M1M5中所占的比例<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>在第一组模拟微生物群落P1P6中，PA和PE酶切模拟结果中位于区间100600bp的7个片段都被清楚地检测到；在P7中，来自PA的片段在峰图上显示为较低的峰，且与峰图噪音混淆，不易分辨；而在P8中，来自PA的片段不能被检测到。随着P1P6中质粒PA所占百分比的减少，检测结果中PA的比例也逐渐减少，两者呈良好的线性相关(R2=0.9999)(图2);用CHITEST函数检验得出PA在模拟群落中所占比例的检测值和PA在混合群落DNA中所占实际比例没有明显差异(P=0.748)。据此，本实施例能够准确检测到在群落中所占比例最低为0.5%的细菌，并可以准确反映群落结构组成，从而显示不同微生物群落结构的区别。为了验证方法的可重复性，本实施例从扩增标记基因开始重复三次，在图中以误差线代表标准差，可以看出本实施例具有较好的重复性。图2为第一组模拟微生物群落用本实施例分析的结果。在第二组模拟微生物群落的分析结果中，每个群落所检测到的酶切片段数量和片段大小都与理论模拟值一致；图3a中，代表各质粒比例检测值和实际比例的点都位于直线尸x附近，说明二者一致。用CHITEST函数检验同样得出各质粒在模拟群落中所占比例的检测值和群落DNA中的实际比例没有明显差异(P=0.952±0.021)，证明本方法能够准确地反映微生物群落中细菌的组成比例；构建各群落的5个质粒在M广M5各群落检测结果中所占比例与群落DNA中实际比例均呈现良好的线性相关性(R2=0.989±0.007)(图3b)，证明本实施例能够准确检测出不同微生物群落的区别。本实施例同样重复三次，并计算各片段长度和丰度百分比数值的标准差，在图中以误差线表示，显示本方法具有很好的重复性和稳定性。图3第二组模拟微生物群落用本发明方法分析的结果，a群落实测酶切片段所计算的质粒含量与实际含量的回归曲线，b不同微生物群落中质粒A的实测计算含量与实际含量的回归曲线。实施例2本实施例是以皮下注射化学致癌剂1，2-二甲肼(1,2-dimethylhydrazine)诱导结肠癌癌前病变大鼠模型为对象，对结肠癌癌前病变形成过程中肠道菌群组成的渐进性变化进行分析。实验设对照组(6只大鼠，记为A-F)和造模组(6只大鼠，记为G-L)，造模组分两次注射造模剂1，2-二甲肼，间隔为一周，对照组注射安慰剂。在第二次注射造模剂前及之后六周各采集一次粪便样品。后一次粪便样品收集完毕之后，对大鼠进行解剖，发现造模组6只大鼠肠壁上均有异常隐9窝病灶生成，数量为37.7±2.6个，证明结肠癌癌前病变确实在造模组中发生。而对照组6只大鼠肠壁均无异常隐窝病灶生成。提取每份粪便样品中的细菌总DNA用于后续分析。对造模组和对照组大鼠在上述两个时间点的肠道菌群用ARDRA，DGGE和454测序方法证明随着时间变化，两组大鼠的肠道菌群在前后两个时间点均发生了一定的变化，提示大鼠肠道菌群变化与其自身生长有关；同时在造模前两组大鼠的肠道菌群没有明显差异，而在造模六周后，两组大鼠的肠道菌群有明显差异，说明癌前病变的发生发展与肠道菌群的改变相关。用本实施例造模组和对照组大鼠在上述两个时间点的肠道菌群结构，并与ADRDA结果作比较。ARDRA分析得到的片段数目和长度值与本方法检测结果相似，但本实施例可以有效分别的一组大小为350400bp的片段在ARDRA中无法分辨(附图lb)。对本实施例所测定的不同样本的微生物群落的结构进行比较分析，各样本的荧光标记限制性片段的组成(包括片段大小与丰度)图谱信息可以转化为一列数据矩阵，多个样本组成的数据矩阵可以采用多元变量统计学分析，包括主成分分析(PCA)等各种统计学分析方法，从而找出不同样本微生物群落结构的特征和变化规律。造模组和对照组大鼠在两个时间点的肠道菌群结构的主成分分析(PCA)结果可看出随着时间变化，模型组和对照组大鼠的肠道菌群沿所占比例最大的主成分1(PC1)方向发生了变化，说明在此实验中，与时间相关的生长因素是造成肠道菌群变化的主要原因；而比较造模组和对照组大鼠的肠道菌群，本实施例在造模前时间点，代表两组肠道菌群的点混杂在一起，说明它们之间没有明显差异。而在造模六周后的时间点，代表两组肠道菌群的点分开了，说明这时两组之间的肠道菌群有了明显的差异。这说明，结肠癌癌前病变造模过程与肠道菌群的改变相关(附图4a)。将不同时间点两组的肠道菌群结构分别进行分析，也能得到一样的结果在造模前时间点，两组肠道菌群没有明显差异(附图4d);在造模六周后，两组之间的肠道菌群有了明显的差异(附图4g)。图4动物肠道微生物群落10用本发明方法和T-RFLP法分析结果的比较a用本方法对模型组和对照组大鼠在两个时间点的肠道菌群检测结果的PCA分析；b用基于限制性内切酶Mspl的T-RFLP对模型组和对照组大鼠两个时间点的肠道菌群检测结果的PCA分析；c用基于限制性内切酶Mspl，Hhal和HaeIII的T-RFLP对模型组和对照组大鼠两个时间点的肠道菌群检测结果的PCA分析；d用本方法对模型组和对照组大鼠造模前的肠道菌群检测结果的PCA分析；e用基于限制性内切酶Mspl的T-RFLP对模型组和对照组大鼠造模前的肠道菌群检测结果的PCA分析；f用基于限制性内切酶Mspl，Hhal和HaeIII的T-RFLP对模型组和对照组大鼠造模前的肠道菌群检测结果的PCA分析；g用本方法对模型组和对照组大鼠造模六周后的肠道菌群检测结果的PCA分析；h用基于限制性内切酶Mspl的T-RFLP对模型组和对照组大鼠造模六周后的肠道菌群检测结果的PCA分析；i用基于限制性内切酶MspI，Hhal和HaeIII的T-RFLP对模型组和对照组大鼠造模六周后的肠道菌群检测结果的PCA分析。其中，模型组动物由黑色实心图标表示，对照组动物由空心图标表示。A表示造模前样本，O表示造模六周后样本。各图中纵横坐标中各PC表示相应的主成分因子。同时用T-RFLP技术对上述24个样本进行分析，以荧光标记的16SrRNA基因全长通用引物27f(5，-Cy5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492r(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT)对16SrRNA基因序列进行扩增，扩增片段以限制性内切酶进行酶切。使用的限制性内切酶有Mspl(5'-C"CGG)，Hhal(GCG'C)和HaeIII(GG"CC)。首先将Mspl酶切得到的图谱信息加以解译，转化为数据矩阵用于PCA分析；其次，将三种限制性内切酶得到的图谱综合加以解译，转化为数据矩阵用于PCA分析。在由Mspl酶切数据得到的PCA图中，本实施例在造模前，两组大鼠的肠道菌群没有差异，而在造模六周后，两组大鼠的肠道菌群显示出一定的分开趋势，但区别并不明显(附图4b，e，h);而在三种限制性内切酶综合数据得到的PCA图中，造模前两组的肠道菌群同样没有区别，而造模六周后，两组的肠道菌群则被明显地分开了(附图4c，f，i)。T-RFLP的分析结果与本方法分析结果在一定程度上相互映证。但同时也能够看到，当仅将MspI酶切数据用于分析的时候，造模后六周的两组大鼠肠道菌群区别并不明显，而多种酶切的综合数据却能够将这两者的区别显示出来，与前文所述的本方法得到的结论一致，且与DGGE、454测序结果一致。本实施例结果说明，T-RFLP在对构成极为复杂的微生物群落进行分析时，由于信息量有限带来分辨率不够高的问题，需要对相同的样本用多种限制性内切酶进行酶切并对酶切图谱综合进行，才能够揭示不同微生物群落之间的区别。本实施例作为同样基于毛细管电泳的方法，也具有高通量、高重复性和高灵敏度等优点，同时能够对酶切得到的全部限制性片段多态性进行分析，因而能够得到更多的信息量，从而能够对微生物群落的结构作比较全面的分析。综上所述，上述实施例结合了限制性酶切多样性分析和毛细管电泳技术的优点，既能够全面深入地分析微生物群落的结构和功能，又具有高通量、高灵敏度和高稳定性的特征，因而能够同时对大量的微生物群落样品进行分析，比较微生物群落结构的遗传多样性，也能够快速灵敏地检测生态系统的动态变化。权利要求1、一种利用荧光标记酶切基因进行微生物群落结构分析的方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一，提取样本的基因组总DNA，扩增微生物系统发育标记基因；步骤二，利用限制性内切酶对扩增得到的标记基因进行酶切，得到带有粘性末端的限制性片段；步骤三，对所有限制性片段进行末端荧光标记；步骤四，运用DNA遗传分析仪分离并检测已被末端荧光标记的限制性片段，得到样本的微生物组成信息图谱；步骤五，对信息图谱进行多元变量统计学分析，获得微生物群落结构信息特征与变化规律。2、根据权利要求1所述的利用荧光标记酶切基因进行微生物群落结构分析的方法，其特征是，步骤二中，所述酶切具体为，采用4核苷酸识别位点的限制性内切酶对标记基因进行酶切，获得具有粘性末端的酶切片段。3、根据权利要求1所述的利用荧光标记酶切基因进行微生物群落结构分析的方法，其特征是，步骤三中，所述末端荧光标记具体为，使用DNApolymeraseKlenow酶进行荧光标记，标记所用的底物是与酶切后得到的粘性末端碱基互补配对的脱氧单核苷酸。4、根据权利要求1所述的利用荧光标记酶切基因进行微生物群落结构分析的方法，其特征是，步骤四中，所述分离并检测具体为，利用DNA遗传分析仪进行检测。5、根据权利要求1所述的利用荧光标记酶切基因进行微生物群落结构分析的方法，其特征是，步骤五中，所述多元变量统计学分析为主成分分析。全文摘要一种生物
技术领域：
的利用荧光标记酶切基因进行微生物群落结构分析的方法，包括如下步骤提取样本的基因组总DNA，扩增微生物系统发育标记基因；利用限制性内切酶对扩增得到的标记基因进行酶切，得到带有粘性末端的限制性片段；对所有限制性片段进行末端荧光标记；运用DNA遗传分析仪分离并检测已被末端荧光标记的限制性片段，得到样本的微生物组成信息图谱；对信息图谱进行多元变量统计学分析，获得微生物群落结构信息特征与变化规律。本发明的方法利用了毛细管电泳的高通量、高灵敏度和高重复性等优点，能够有效全面地获得微生物群落结构信息。文档编号G01N21/76GK101565750SQ20091005246公开日2009年10月28日申请日期2009年6月4日优先权日2009年6月4日发明者张晓君,张梦晖,王婷婷,赵立平申请人:上海交通大学