本发明属于微生物领域，特别涉及一种自然发酵豆酱中菌体宏蛋白质组的提取方法。
背景技术：
我国的自然发酵豆酱历史悠久，是劳动人民智慧的结晶。然而自然发酵豆酱也面临一系列的问题：如高盐、不适应现代健康的要求，易受到杂菌、有害菌的污染等。因此，对自然发酵豆酱的深入研究迫在眉睫。
宏蛋白质组指的是环境混合微生物群落中所有生物的蛋白质组总和，对宏蛋白质组进行研究的方法称为宏蛋白质组学技术。将此方法用于豆酱中微生物的研究，可减小对所研究的微生物群体的限制性，也不必预先筛选出特定的蛋白质，一次性可做大量研究，便于对豆酱中的微生物有一个宏观全面的了解。宏蛋白组学的研究过程包括蛋白质样品的处理、分离、分析鉴定等。样品处理的好坏直接决定了后续实验的结果，本发明提供一种自然发酵豆酱中菌体宏蛋白质组的提取方法，为后续研究奠定了基础。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种自然发酵豆酱中菌体宏蛋白质组的提取方法，用于豆酱中微生物的研究，能减小对所研究的微生物群体的限制性，也不必预先筛选出特定的蛋白质，一次性可做大量研究。
本发明提供的技术方案包括以下步骤：将新鲜采集的自然发酵豆酱于离心桶中，低速离心除去杂质，高速离心得到菌体，液氮研磨破碎菌体，TCA-丙酮沉淀蛋白质，丙酮清洗除杂，冰上风干得到粗蛋白质，加入裂解液，超声助溶，离心后得到蛋白质清液，采用SDS-PAGE和质谱进行检测。
本发明的积极效果：用于豆酱中微生物的研究，能减小对所研究的微生物群体的限制性，也不必预先筛选出特定的蛋白质，一次性可做大量研究。
具体实施方式
A、采用自然发酵的方法制作豆酱：10公斤新收获的东北大豆洗净，浸泡24小时后置于铁锅中蒸煮4小时，将煮熟的豆粒绞碎制成200g左右的长方体形状，放在阳光下晾干后包上纸，白天接受日晒，夜间拿到室内，发酵两个月制成酱醅,期间每5天取样一次。
将酱醅表面菌毛洗净，破碎后放入缸中，加入水和盐，酱醅：盐：水比例为1:0.7:1.5，混合均匀，缸上覆盖纱布，静置发酵三天后每天上下翻酱一次，一个月后酱成，期间每5天取样一次。
B、取新鲜采集的豆酱或酱醅70g放于500ml离心桶中，加入200ml磷酸盐缓冲液（0.1mol/L，pH=7.0），放入直径1cm的玻璃珠30颗，人工震荡离心桶10分钟；
C、将玻璃珠取出，2000r/min，离心10分钟，取出上清液；沉淀物中加入150ml磷酸盐缓冲液摇匀，2000r/min，离心10分钟，取出上清液；重复一次；
D、将所有上清液2000r/min，离心20分钟，收集上清，弃去沉淀物；
E、将所有上清液6000r/min，离心20分钟，弃去上清，收集沉淀物；
F、沉淀物用5ml磷酸盐缓冲液清洗后6000r/min，离心20分钟得到菌体沉淀物；
G、菌体沉淀物进行液氮研磨，研磨成粉后，平均转移至3个2ml离心管，每管加入1.5ml10%（质量：体积）的TCA-丙酮，-20℃过夜；
H、10000r/min，离心20分钟，弃去上清，向沉淀物中加入1.5ml丙酮清洗，放入-20℃冰箱沉淀2小时，10000r/min，离心20分钟，弃上清，收集沉淀物；重复两次；
I、沉淀物冰上风干成粉后，按照0.1g/ml加入裂解液，26w超声助溶10分钟，工作2秒停3秒，10000r/min，离心1小时，取上清，即为蛋白质清液；
J、采用SDS-PAGE和质谱进行检测：对提取的蛋白质进行电泳实验，分离胶浓度为12％（体积：体积），浓缩胶浓度为5％（体积：体积）。电泳时间设置为80v，15min；120v至跑完。利用Image Lab 软件对所得的SDS-PAGE 电泳胶图进行扫描。将电泳后的蛋白条带切下，分别放入2ml离心管中，脱色后经胰蛋白酶消化，并利用液质联用质谱仪（Bruker Daltonics Co.miroTOF-QΙΙ型）对肽段样品进行质谱分析，用2.3.01版本的Mascot数据搜索软件搜索uniprot20140225数据库，得到匹配蛋白。
试剂配制：
1. 0.1mol/L，pH=7.0磷酸盐缓冲液（1000ml）：
（1）0.1mol/L磷酸氢二钾溶液（1000ml）：称取22.8220g磷酸氢二钾于1000ml容量瓶中，加入去离子水混匀定容。
（2）0.1mol/L磷酸二氢钾溶液（1000ml）：称取13.6090g磷酸二氢钾于1000ml容量瓶中，加入去离子水混匀定容。
取610ml溶液（1）和390ml溶液（2）混匀，加入8g氯化钠，0.2g氯化钾混匀后，调pH至7.0，现用现配。
2.裂解液（20ml）：称取尿素8.4081g，硫脲3.0448g，CHAPS（3-[3-（胆酰胺基丙基）二甲氨基]丙磺酸盐）0.8g ，蛋白酶抑制剂PMSF（苯甲基黄酰氟）0.0035g，DTT（二硫苏糖醇）0.2g于20ml容量瓶中，加入去离子水混匀后定容，现用现配。
3.10%TCA-丙酮（100ml）：取10gTCA于100ml容量瓶，加入冰丙酮混匀后定容。
4.12%分离胶（10ml）：水3.35ml，30%（质量：体积）丙烯酰胺混合液4.0ml，1.5mol/LTris（三羟甲基氨基甲烷）(pH8.8)2.5ml，10%（质量：体积）SDS（十二烷基硫酸钠）0.1ml，10%（质量：体积）AP（过硫酸铵）0.15ml，最后加入TEMED（四甲基乙二胺）0.015ml混合均匀。
5.5%浓缩胶（3ml）：水2.1ml，30%丙烯酰胺混合液0.5ml，1.5mol/LTris(pH6.8)
0.38ml，10%SDS0.03ml，10%AP0.03ml，最后加入TEMED0.003ml混合均匀。
实施例1
1）采用自然发酵的方法制作豆酱：10公斤新收获的东北大豆洗净，浸泡24小时后置于铁锅中蒸煮4小时，将煮熟的豆粒绞碎制成200g左右的长方体形状，放在阳光下晾干后包上纸，白天接受日晒，夜间拿到室内，发酵两个月制成酱醅。将酱醅表面菌毛洗净，破碎后放入缸中，加入水和盐，酱醅：盐：水比例为1:0.7:1.5，混合均匀，缸上覆盖纱布，静置发酵三天后每天上下翻酱一次，一个月后酱成。
2）取新鲜采集的豆酱70g放于500ml离心桶中，加入200ml磷酸盐缓冲液（0.1mol/L，pH=7.0），放入直径1cm的玻璃珠30颗，人工震荡离心桶10分钟；
3）将玻璃珠取出，2000r/min，离心10分钟，取出上清液；沉淀物中加入150ml磷酸盐缓冲液摇匀，2000r/min，离心10分钟，取出上清液；重复一次；
4）将所有上清液2000r/min，离心20分钟，收集上清，弃去沉淀物；
5）将所有上清液6000r/min，离心20分钟，弃去上清，收集沉淀物；
6）沉淀物用5ml磷酸盐缓冲液清洗后6000r/min，离心20分钟得到菌体沉淀物；
7）菌体沉淀物进行液氮研磨，研磨成粉后，平均转移至3个2ml离心管，每管加入1.5ml10%（质量：体积）的TCA（三氯乙酸）-丙酮，-20℃过夜；
8）10000r/min，离心20分钟，弃去上清，向沉淀物中加入1.5ml丙酮清洗，放入-20℃冰箱沉淀2小时，10000r/min，离心20分钟，弃上清，收集沉淀物；重复两次；
9）沉淀物冰上风干成粉后，按照0.1g/ml加入裂解液，26w超声助溶10分钟，工作2秒停3秒，10000r/min，离心1小时，取上清，即为蛋白质清液；
10）采用SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酞胺凝胶电泳）和质谱进行检测：对提取的蛋白质进行电泳实验，分离胶浓度为12％（体积：体积），浓缩胶浓度为5％（体积：体积）。电泳时间设置为80v，15min；120v至跑完。利用Image Lab 软件对所得的SDS-PAGE 电泳胶图进行扫描。将电泳后的蛋白条带切下，分别放入2ml离心管中，脱色后经胰蛋白酶消化，并利用液质联用质谱仪（Bruker Daltonics Co.miroTOF-QΙΙ型）对肽段样品进行质谱分析，用2.3.01版本的Mascot数据搜索软件搜索uniprot20140225数据库，得到匹配蛋白。
实施例2
1）采用自然发酵的方法制作酱醅：10公斤新收获的东北大豆洗净，浸泡24小时后置于铁锅中蒸煮4小时，将煮熟的豆粒绞碎制成200g左右的长方体形状，放在阳光下晾干后包上纸，白天接受日晒，夜间拿到室内，发酵两个月制成酱醅，期间每5天取样一次。
2）取新鲜采集的酱醅70g，破碎后放于500ml离心桶中，加入200ml磷酸盐缓冲液（0.1mol/L，pH=7.0），放入直径1cm的玻璃珠30颗，人工震荡离心桶10分钟；
3）将玻璃珠取出，2000r/min，离心10分钟，取出上清液；沉淀物中加入150ml磷酸盐缓冲液摇匀，2000r/min，离心10分钟，取出上清液；重复一次；
4）将所有上清液2000r/min，离心20分钟，收集上清，弃去沉淀物；
5）将所有上清液6000r/min，离心20分钟，弃去上清，收集沉淀物；
6）沉淀物用5ml磷酸盐缓冲液清洗后6000r/min，离心20分钟得到菌体沉淀物；
7）菌体沉淀物进行液氮研磨，研磨成粉后，平均转移至3个2ml离心管，每管加入1.5ml10%（质量：体积）的TCA-丙酮，-20℃过夜；
8）10000r/min，离心20分钟，弃去上清，向沉淀物中加入1.5ml丙酮清洗，放入-20℃冰箱沉淀2小时，10000r/min，离心20分钟，弃上清，收集沉淀物；重复两次；
9）沉淀物冰上风干成粉后，按照0.1g/ml加入裂解液，26w超声助溶10分钟，工作2秒停3秒，10000r/min，离心1小时，取上清，即为蛋白质清液；
10）采用SDS-PAGE和质谱进行检测：对提取的蛋白质进行电泳实验，分离胶浓度为12％（体积：体积），浓缩胶浓度为5％（体积：体积）。电泳时间设置为80v，15min；120v至跑完。利用Image Lab 软件对所得的SDS-PAGE 电泳胶图进行扫描。将电泳后的蛋白条带切下，分别放入2ml离心管中，脱色后经胰蛋白酶消化，并利用液质联用质谱仪（Bruker Daltonics Co.miroTOF-QΙΙ型）对肽段样品进行质谱分析，用2.3.01版本的Mascot数据搜索软件搜索uniprot20140225数据库，得到匹配蛋白。