船舶压载水微生物总dna提取及多样性分析的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于环境微生物分子生态学领域，具体涉及一种船舶压载水微生物总DNA 提取及多样性分析的方法。
【背景技术】
[0002] 船舶压载水是船舶在空载时为了保持船体稳定性，在起航时压载进船舶压载舱的 海水，抵达港口载货时则被排出压载舱。压载水及沉积物的排放是海洋生物在出发港和目 的地港之间传播的主要途径，已被世界环保基金（GEF)认定为海洋面临的四大威胁之一。
[0003] 船舶到港装货的同时将卸载压载水，同时对压载舱清理，由于压载舱的特殊结构， 不能达到彻底清理，随船舶每次压载当地新鲜海水，带入压载舱的生物和非生物组成多样， 压载水沉积物随着压载水的排入排出长期积累沉降。压载舱作为船舶存放压载水的特殊舱 室，其结构复杂，压载舱内无光、缺氧、有的还可能含有有害物质，对生物的生存是极为不利 的，大部分生物无法忍受压载舱中的恶劣环境而死亡，大量不能适应压载舱环境的生物死 亡后，其尸体下沉落入舱底，给食腐生物提供了食物来源。由于船舶具有高的表面积与体积 比，大面积的微生物附着在其表面，所以压载舱成了微生物的避难所，这种情况被称作"船 体内部污垢"。目前通过船舶压载水和沉积物的排放，有害微生物可能在港口国之间传播， 致病微生物可能会对环境内生物和人造成威胁，现阶段船舶压载水和沉积物中微生物生存 状态并未完全探宄，微生物的多样性还不明了。
[0004] 目前国内压载水微生物多样性的研宄主要是在港口调查停靠船舶压载水中细菌 总数、大肠菌群等卫生指示菌和某些致病菌。利用分子生物学手段对船舶压载水中微生物 进行研宄还未完全展开，而微生物DNA提取作为分子生物学手段进行分析的第一步也是最 重要的一步，其方法的研宄还未见报道。
[0005] 变性梯度凝胶电泳（DGGE)最初被用于基因的突变检测，变性梯度凝胶电泳对不 同DNA片段的分离原理是变性梯度凝胶电泳（DGGE)中同样长度但具有不同序列的DNA片 段能够被分离。具有不同序列的DNA分子有不同的解链行为，将在凝胶的不同位置停止迀 移。变性梯度凝胶电泳（DGGE)是建立在PCR反应对环境样品中的所有微生物的16SrRNA 和18SrRNA等保守基因区间的DNA片断的扩增的基础上，这些被扩增出的DNA片断可以代 表所有不同微生物的信息，这些使用同一引物对扩增出的不同微生物的DNA片断具有相同 的碱基数，因此一般的电泳无法将它们分离开。由于变性梯度凝胶电泳（DGGE)可以将不同 碱基顺序的相同大小的DNA片段予以分离，所运用PCR-DGGE技术可以对环境样品中的微生 物多样性进行研宄。
[0006] 压载舱结构和压载水配给规律导致船舶压载水的物理、化学性质与河水、海水和 环境污水存在高度差异，微生物数量和种群分布也明显不同，这就决定了不同环境下的样 品在进行微生物群落构成分析时存在差异。目前国内外尚无关于运用PCR-DGGE技术进行 船舶压载水微生物多样性研宄的相关报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种船舶压载水微生物总DNA提取及多样性分析的方法； 本发明根据船舶压载水的特性，使用3 μ m和0. 22 μ m微孔滤膜的两级过滤和冷冻固定，加 固了微生物在滤膜上的附着，使用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)处理，去除对DNA提取造 成影响的物质，使得微生物总DNA的纯度达到直接进行后续分子生物学研宄的需要，提取 的DNA片段可进行16SrDNA的扩增及变性梯度凝胶电泳，使用QuantityOne软件对变性梯 度凝胶电泳分离电泳图进行数字化分析，判断船舶压载水微生物种群多样性程度，通过对 特异条带切胶回收、克隆测序并进行BLAST序列比对，可以得出压载水优势菌群的种类，从 而确定微生物群落结构组成。
[0008] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
[0009] 本发明提供了一种船舶压载水微生物总DNA提取及多样性分析的方法，该方法包 括以下步骤：
[0010] 1)收集船舶不同压载舱压载水样品；
[0011] 2)对船舶压载水样品进行预处理；
[0012] 3)提取预处理后样品中微生物总DNA ;
[0013] 4)对粗提DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，得粗提压载水微生物总DNA琼脂糖凝胶 电泳图，判断总DNA提取是否成功；
[0014] 5)以提取的总DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增；所述专用引物的 序列如 SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2 所示；
[0015] 上游引物 357F-GC(SEQ IDNO. 1):
[0016] 5， -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3,，
[0017] 和下游引物 518R(SEQ ID NO. 2) :5' -ATTACCGCGGCTGCTGG-3';
[0018] 6)将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，得PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图， 并判断总DNA片段在专用引物的引导下是否扩增成功；
[0019] 7)将PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳，得变性梯度凝胶电泳分离电泳图，判 断船舶压载水微生物种群多样性程度和压载水优势菌群的种类，分析船舶压载水微生物多 样性。
[0020] 优选地，步骤1)中所述的不同压载舱为：船舶不同空间位置的压载舱。
[0021] 优选地，步骤2)中所述预处理包括：过滤抽取微生物，冷冻固定。具体为：依次使 用3 μπι和0· 22 μπι微孔滤膜进行两级过滤抽取微生物、冷冻固定。
[0022] 优选地，步骤3)中所述的提取方法如下：使用2% (m/v)十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)处理预处理后的样品后，使用3S DNA Isolation提取试剂盒进行提取，操作步骤根 据试剂盒的说明进行。
[0023] 优选地，步骤4)中所述对粗提DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测包括：用1%的琼脂 糖凝胶电泳检测粗提DNA ;染色拍照。
[0024] 更优选地，步骤4)中所述的对粗提DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测为：以每个样品 5 yL的上样量，I yL 6 X Loadding buffer在1%的琼脂糖凝胶上电泳检测PCR扩增片段， 电泳缓冲液为IXTAE缓冲；电压140V，时间20min ;用DL500DNA Maker作标准分子量参照 物；电泳结束后用EB避光染色40min，用凝胶成像系统观察结果并拍照，得粗提压载水微生 物总DNA琼脂糖凝胶电泳图。
[0025] 优选地，步骤5)中所述PCR扩增所采用的PCR反应体系为：35 μ LddH2O, 5uL含 15mmol/L镁离子的10*反应缓冲液，I yL上游引物357F-GC(SEQ ID NO. 1)，1 yL下游引物 518R(SEQIDN0.2)，5μL脱氧核糖核酸，lμLTaq酶，2 μL模板；PCR扩增程序为：起始95°C 预变性5min，94°C变性lmin，65°C退火Imin (每个循环退火温度降低0. 5°C )，72°C引物延 伸308,20个循环；94°〇变性111^11，55°〇退火11^11，72°〇引物延伸308，15个循环 ；72°〇终延 伸8min ;4°C保存PCR扩增产物。
[0026] 优选地，步骤6)中所述的琼脂糖凝胶电泳检测如下：用1%的琼脂糖凝胶电泳检 测PCR扩增产物；染色拍照。
[0027] 更优选地，步骤6)中所述的对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测为：以每个 样品5 yL的上样量，I yL 6 X Loadding buffer在1%的琼脂糖凝胶上电泳检测PCR扩增 片段，电泳缓冲液为I X TAE缓冲；电压140V，电泳时间为20min ;电泳结束后用EB避光染色 40min，用凝胶成像系统观察结果并拍照，得PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。
[0028] 优选地，步骤7)中所述的变性梯度凝胶电泳包括：在基因突变检测系统上对PCR 反应产物进行电泳分离；电泳结束后染色拍照。
[0029] 更优选地，步骤7)中所述将PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳为：制作变性剂 梯度为35 %~65 %、丙烯酰胺强度为8 %的凝胶；组装放入含有I X TAE缓冲液的电泳槽 中，预热到60°C;每孔加入30yL的PCR反应产物和15yL的6XLoadding buffer ;接通电 泳电源，在160V、60°C条件下电泳16h ;电泳结束后，小心取出凝胶，EB避光染色20min，在清 水中退染20min，然后用凝胶成像系统观察结果并拍照，得变性梯度凝胶电泳分离电泳图。
[0030] 优选地，步骤7)中还包括：使用Quantity One软件对变性梯度凝胶电泳分离电泳 图进行数字化分析，得到变性梯度凝胶电泳条带强度图，根据每个条带的相对灰度计算细 菌群落结构多样性指数H'和均匀度指数J，进而判断出船舶压载水微生物种群多样性程 度。
[0031] 优选地，步骤7)中还包括：对获得的变性梯度凝胶电泳分离电泳图电泳谱带的特 异条带切胶回收、克隆测序并进行BLAST序列比对，可以得出压载水优势菌群的种类，从而 确定微生物群落结构组成。
[0032] 更优选地，本发明的船舶压载水微生物总DNA提取及多样性