用于环境真菌生物多样性高通量测序的复合标签及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因测序技术领域，具体设及一种用于环境真菌生物多样性高通量测 序的复合标签，用于超高通量基因测序。
【背景技术】
[0002] 微生物群落多样性是微生物生态学和环境学研究的重点之一。目前利用宏基因组 研究微生物多样性越来越受到科学家们的关注，但由于对于同一个样本来说，宏基因组研 究的结果中往往细菌的数量占大多数而使得真菌等微生物种类远少于细菌。运对于某些领 域的研究非常不利，如对酿酒过程中各个时期的微生物种群研究，真菌的作用远高于细菌， 对酒类品质的影响较大。因此利用真菌独特的内转录间隔区序列为祀序列，用PCR扩增的 方法从复杂样本中富集真菌DNA成为非常有效的方法。
[0003] Handelman(HandelsmanJ,RondonMR,BradySF.molecularbiologialaccess tothechemistryofunkownsoilmicrobes:Anewfrontierfornaturalproducts[J ].1998, 5(10) :R245-R249.)等（1998)首次提出宏基因组的概念，其定义为"thegenomes ofthetotalmicrobiotafoundinna1:ure"，即环境中全部微小生物遗传物质的总和。它 包含了可培养的和未可培养的微生物的基因组总和。本发明所指的宏内间隔序列是指环境 中全部真菌内间隔序列的总和，为微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作 关系及与环境之间的关系为研究目的提供了一条新的思路。
[0004] 核糖体RNA(rRNA)由于功能上高度保守，序列上不同位置具有不同的变异速率， 是目前在微生物分子生态学上应用最广泛的分子标记。真核生物基因组中编码核糖体RNA 的基因包括28SrDNA、5SrDNA、18SrDNA和5. 8SrDNA4种，它们在染色体上头尾相连、串 联排列，相互之间由间隔区分隔（匡治州，许杨.核糖体rDNAITS序列在真菌学研究中的 应用口].生命的化学，2004(02):120-122.)。其中185、5.85和285扣臟基因组成一个转 录单元，Ξ者高度保守，适合于较高等级水平的生物群体间的系统分析，其间的间隔区为 内转录间隔区（Internal^TranscribedSpacer,ITS)，包括18S和5. 8S之间的内转录间隔 区l(ITSl)及5. 8S和28S之间的内转录间隔区2QTS2)两部分，由于ITS不加入成熟核 糖体，所W受到的选择压力较小，进化速率较快，在绝大多数的真核生物中表现出了极为广 泛的序列多态性。同时ITS序列长度适中，从人类到酵母的各种真核生物中ITS的序列长 度为lOOObp到小于300bp大小不等，人们可W从不太长的序列中获得足够的信息，可广泛 用于属内种间或种内群体的系统学研究（IwenPC,HinrichsSH,Ru卵ΜE.化ilization oftheintern曰1transcribedsp曰cerregions曰smolecul曰rt曰rgetstodetect曰nd identifyhumanfungalpathogens[J].MedMycol, 2002, 40(1):87-109)。
【发明内容】
阳〇化]本发明提供一种用于环境真菌生物多样性高通量测序的复合标签及其应用，提高 超高通量测序的样本通量，有效降低超高通量测序成本，有效富集样本中整个微生物种群 中的真菌种群，为探明环境中真菌多样性研究提供高通量分析途径。 阳006] -种用于环境真菌生物多样性高通量测序的复合标签，其序列如如下序列编号 NO. 1 ~NO. 48 所示。
[0007] 本发明复合标签的每一条序列由左侧8-10个碱基组成具唯一性标签和右侧21个 源于真菌内转录间隔区1的序列组成的标签复合而成。
[0008] 表 1
[0009] 阳010」
[0011] 本发明还提供一种真菌高通量基因测序方法，包括如下步骤： 阳〇1引 （1)提取每一个样本的总DNA;
[0013] (2)对每一个样本，从权利要求1中所示48对且未被选择过的序列中选择任一一 对序列作为引物，对对应样本的总DNA进行扩增；
[0014] (3)对每一个样本的扩增产物进行电泳检测，对扩增产物进行纯化回收；
[0015] (4)对每个样本纯化回收后的产物紫外分光光度计精确定量；
[0016] (5)将所有样本等量混合后建立一个测序文库；
[0017] (6)对所建测序文库进行高通量测序。
[0018] 本发明所述真菌宏内转录间隔区序列是指所有落在真菌18S和5. 8S之间的内转 录间隔区1的总和，复合标签如表1所示；利用表1的真菌宏内转录间隔区序列复合标签可 达到在一次超高通量测序中同时对1~48个样本中的真菌宏内间隔序列进行检测。
[0019] 利用目前超高通量测序自身提供96种测序标签（8-10个碱基），可做96个样本， 但在超高通量测序前先对96个样本分别建96个测序库，然后等量混合成1个再同时测序， 而本发明只需建1个测序库就能对48个样本同时测序。如果将测序自带的96个标签和本 发明的48个复合标签结合使用，则同时可对96*48个样本的内转录间隔序列进行超高通量 测序。
[0020] 步骤（1)中对每个样本总DNA提取采用通用提取方法。
[0021] 步骤（2)中对每一个样本从表1所示48对且未被选择过的序列中选择任一一对 序列作为引物，其选择原则具体为：确定每一样本的编号，对每一个编号样本，从表1中选 择一序列编号所对应的序列1和序列2 (NO. 1的序列1和序列2为一对，NO. 2的序列1和 序列2为一对，NO. 3的序列1和序列2为一对W此类推），确定每一个样本的一对序列；每 个编号的样本可选表1中48对中的任何一对，但要求不同编号的样本之间从表1选择时不 要重合，即不同编号样本不选择同一个复合标签。 阳〇2引步骤似中对对应样本的总DNA进行扩增的扩增体系为：
[0023] PCR扩增的 50μΙ体系中含：50ng样本总DNA，4yLMg2+，5yL10XBuffer，4yL浓 度为5nmoldNTP，1.抓Taq酶，浓度为lOpmol引物各1. 5μL补水至50μL。
[0024] ?〇?扩增程序：94°(：预变性5111111，94°(：变性303,40°(：复性303,72°(：延伸1111111，30 个循环，最后72°C延伸5min，4°C保存。
[00巧]步骤（3)中对每个样本扩增产物进行纯化回收采用通用的PCR产物回收试剂盒。
[0026] 本发明所述高通量测序采用基于IonPGM第二代超高通测序仪的测序平台进行。
[0027] 优选地，步骤（5)中建库所用建库试剂盒为IonPGM第二代超高通测序仪对应的 IonXpress?PlusgDNAFragmentLibraryPreparation试剂盒。
[002引步骤（6)中测序时扩增所用扩增试剂盒为IonPGM第二代超高通测序仪对应的IonPGM?Template0T2400Kit试剂盒。
[0029] 步骤（6)中测序时测序所用测序试剂盒为IonPGM第二代超高通测序仪对应的 IonPGMSequencing400Kit试剂盒。
[0030] 所述样本为含真菌的样本。
[0031] 与现有方法相比，本发明具有如下有益效果：
[0032] 环境中（如±壤）栖居着大量的微生物，运些微生物的分布及其活动与±壤营养 条件，地上植被密切相关。湿地与森林、海洋并称全球Ξ大生态系统，被称为"地球之肾"，具 有丰富的生物多样性。本方法W特定环境中的微生物为研究对象，基于宏基因组学的研究 思路，采用本方法所述的序列，建一个库最多可对48个样本同时进行超高通量测序，进行 基于宏基因组的环境样本中的真菌种群变化规律研究，为各种环境样本进行同类研究提供 方法。
【附图说明】
[0033] 图1是本发明其中一个样本电泳检测结果图。
[0034] 图2是8个样本的超高通量测序结果总览。
【具体实