分析的方法包括以下 具体步骤：
[0033] 1)收集船舶不同压载舱压载水样品：在船舶的不同压载舱中使用采水器采集压 载水，用灭菌蓝口玻璃瓶收集2L样品，4°C保存至样品预处理；
[0034] 2)对船舶压载水样品进行预处理：取压载水样品，经3 μπι和0. 22 μπι微孔滤膜 (滤膜事先灭菌处理）两级过滤后，弃去3 μ m微孔滤膜，0. 22 μ m微孔滤膜上即压载水微生 物；使用灭菌手术镊子，将0.22 μπι滤膜转移到1.5mL离心管中，立即放入-80°C冰箱中冷 冻4h ;取出冷冻后放有微生物滤膜的离心管，使用灭菌手术剪刀和镊子，将0. 22 μ m滤膜剪 碎转移到I. 5mL灭菌离心管中；
[0035] 3)提取预处理后样品中微生物总DNA :向装有滤膜的离心管内加入200 yL 2% (m/v)十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)，65°C水浴Ih ;使用3S DNA Isolation提取试剂盒对 微生物DNA进行提取，向预处理后的样品中加入200 μ L Solution SUS，将样品悬浮起来； 加入400 μ L Solution LYS，300mg石英石，盖上离心管盖，在涡旋振荡器上高速剧烈震荡30 分钟；用台式离心机，12000r/min，室温离心5min ;将上清液完全转移至灭菌I. 5mL离心管 中，加入120 μ L Solution BID，盖上离心管盖，上下颠倒混匀；将溶液用ImL TIP全部转移 至3S柱内，柱子放入2mL离心管中，不盖离心管盖，室温放置5min ;盖上离心管盖，12000r/ min，室温离心5min，取下3S柱，弃去离心管中的废液；将柱子放回同一根离心管中，加入 600 yL Wash Solution，10000r/min，室温离心2min，取下3S柱，弃去离心管中的废液；重 复，将柱子放回同一根离心管中，加入600 yL Wash Solution，10000r/min，室温离心2min， 取下3S柱，弃去离心管中的废液；将柱子放回同一根离心管中，10000r/min，室温离心 2min，以去除残留的Wash Solution ;将TE预热到50-55°C，将柱子放入新的I. 5mL灭菌离 心管中，在柱子中央加入30 μ L TE，将柱子及收集管放置在50-55 °C烘箱中，放置2min，取 出后12000r/min，室温离心Imin ;重复，打开离心管盖，在同一根柱子中央加入30 μ L TE， 放置在50-55°C烘箱中，放置2min，取出后12000r/min，室温离心Imin ;收集管中的液体即 为微生物总DNA ;
[0036] 4)对粗提DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测：以每个样品5 yL的上样量，IyL 6 X Loadding buffer在1 %的琼脂糖凝胶上电泳检测PCR扩增片段，电泳缓冲液为I X TAE 缓冲；电压140V，时间20min ;用DL500DNA Maker作标准分子量参照物；电泳结束后用EB避 光染色40min，用凝胶成像系统观察结果并拍照，得粗提压载水微生物总DNA琼脂糖凝胶电 泳图；
[0037] 5)以提取的总DNA为模板，在专用引物的引导下进行PCR扩增：专用引物为 357F-GC ：
[0038] 5 , -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3 , (S EQ ID NO. 1)和 518R :5 ' -ATTACCGCGGCTGCTGG-3 ' (SEQ ID NO. 2) ;PCR 反应体系为： 35 μ LddH2O, 5 μ L含15mmol/L镁离子的10*反应缓冲液，1 μ L上游引物357F-GC，1 μ L下 游引物518R，5 μ L脱氧核糖核酸，1 μ LTaq酶，2 μ L模板；PCR扩增程序为：起始95°C预变性 5min，94°C变性lmin，65°C退火Imin (每个循环退火温度降低0. 5°C )，72°C引物延伸30s， 20个循环；94°〇变性111^11，55°〇退火11^11，72°〇引物延伸308，15个循环 ；72°〇终延伸81^11; 4°C保存PCR扩增产物；
[0039] 6)对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测：以每个样品5UL的上样量， 1 μ L6XLoadding buffer在1 %的琼脂糖凝胶上电泳检测PCR扩增片段，电泳缓冲液为 IXTAE缓冲；电压140V，时间20min;上样量为5yL PCR扩增产物，IyL 6XLoadding buffer ;用DL500DNA Maker作标准分子量参照物；电泳结束后用EB避光染色40min，用凝 胶成像系统观察结果并拍照，得PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；
[0040] 7)将PCR扩增产物进行变性梯度凝胶电泳：制作变性剂梯度为35 %~65%、丙 烯酰胺强度为8%凝胶；组装放入含有IXTAE缓冲液的电泳槽中，预热到60°C ;每孔加入 30 μ L的PCR反应产物和15 μ L6XLoadding buffer ;接通电泳电源，在160V、60°C条件下电 泳16h ;电泳结束后，小心取出凝胶，EB避光染色20min，在清水中退染20min，然后用凝胶成 像系统观察结果并拍照，得变性梯度凝胶电泳分离电泳图。使用QuantityOne软件对变性 梯度凝胶电泳分离电泳图进行数字化分析，判断船舶压载水微生物种群多样性程度，通过 对特异条带切胶回收、克隆测序并进行BLAST序列比对，可以得出压载水优势菌群的种类， 从而确定微生物群落结构组成。
[0041] 本发明具有如下有益效果：
[0042] 1、针对船舶压载水的特殊性，利用使用3 μ m和0. 22 μ m微孔滤膜的两级过滤和 冷冻固定，加固了微生物在滤膜上的附着，并使用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)处理， CTAB不仅可用于细胞裂解，还有助于去除腐殖酸，得到的DNA纯度较高，A260/A230可达 I. 32±0. 02。所用方法简单方便，不需经纯化即可用于后续的PCR分析和DGGE分析。
[0043] 2、针对船舶压载水的特殊性，本发明的方法省去了冗长、繁琐的DNA洗涤步骤，节 省时间和避免DNA损失，确定了适合于压载水微生物DNA提取的方法，使得操作简便。
[0044] 3、利用本发明方法提取的DNA片段可进行16SrDNA的扩增及变性梯度凝胶电泳， 使用Quantity One软件对变性梯度凝胶电泳分离电泳图进行数字化分析，得到变性梯度凝 胶电泳条带强度图，根据每个条带的相对灰度计算细菌群落结构多样性指数H'和均匀度 指数J，进而判断船舶压载水微生物种群多样性程度，并可对变性梯度凝胶电泳谱带的特异 条带切胶回收、克隆测序，进行BLAST序列比对，从而确定微生物群落结构组成。
【附图说明】
[0045] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0046] 图1为粗提压载水微生物总DNA琼脂糖凝胶电泳图；
[0047] 图2为PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；
[0048] 图3为变性梯度凝胶电泳分离电泳图（a)和条带强度示意图（b);
[0049] 图4为细菌群落结构多样性指数（H')和均匀度指数（J);
[0050]图5为变性梯度凝胶电泳特异条带序列比对结果。
【具体实施方式】
[0051] 下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员 进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保 护范围。
[0052] 实施例
[0053] 选取船舶，进行采样，取船舶不同空间位置的压载舱的压载水，对细菌的种群结构 分析和优势菌群的确定步骤如下
[0054] 1)压载水微生物总DNA提取及检测：
[0055] 在船舶的不同压载舱中使用采水器采集压载水，用灭菌蓝口玻璃瓶收集2L样品， 4°C保存；取压载水样品，经3μπι和0.22μπι微孔滤膜（滤膜事先灭菌处理）两级过滤后， 弃去3 μ m微孔滤膜，0. 22 μ m微孔滤膜上即压载水微生物；使用灭菌手术镊子，将0. 22 μ m 滤膜转移到I. 5mL离心管中，立即放入-80°C冰箱中冷冻4h ;取出冷冻后放有微生物滤膜 的离心管，使用灭菌手术剪刀和镊子，将0.22 μ m滤膜剪碎转移到1.5mL灭菌离心管中；向 装有滤膜的离心管内加入200 μ L 2% (m/v)十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)，65°C水浴Ih; 使用3S DNA Isolation提取试剂盒对微生物DNA进行提取，向经CTAB处理后的样品中加 入200 μ L Solution SUS，将样品悬浮起来；加入400 μ L Solution LYS和300mg石英石， 盖上离心管盖，在涡旋振荡器上高速剧烈震荡30分钟；用台式离心机，12000r/min，室温离 心5min ;将上清液完全转移至灭菌I. 5mL离心管中，加入120 μ LSolution BID，盖上离心管 盖，上下颠倒混匀；将溶液用ImL TIP全部转移至3S柱内，柱子放入2mL离心管中，不盖离 心管盖，室温放置5min ;盖上离心管盖，12000r/min，室