专利名称：：一种检测发酵蔬菜中原核微生物多样性的方法
技术领域：
：本发明涉及微生物检测技术，具体地说是一种应用分子手段检测发酵蔬菜中原核微生物多样性的方法。
背景技术：
：蔬菜发酵体系是一种独特的微生态环境。其中的微生物(原核微生物)与发酵蔬菜制品的品质和风味有直接的关系，对发酵蔬菜中微生物的多样性及其所扮演角色进行调查研究为改进传统蔬菜发酵工艺、探究发酵菜风味形成机理等方面提供可供参考的数据。据资料报道，前人用微生物培养方法[1]和非培养方法(分析脂肪酸的方法[2-3和分析细胞碳源利用["])对发酵蔬菜中乳酸菌作系统分类法的研究。微生物的培养分离方法是在人工配制的培养基上接入发酵蔬菜水样品，以一定的培养条件下培养发酵蔬菜水中微生物的方法，这种方法由于使用的培养基和培养条件和发酵蔬菜体系中营养、环境条件不完全相同，不可避免地会造成菌株的富集和衰退，这就人为改变了原始发酵蔬菜体系中菌群的微生态构成，会对研究结果造成较大的偏差。可能在发酵蔬菜体系中占主要地位或含量很高的菌群在培养基中无法培养或生长很差。反而用培养分离法从发酵蔬菜中分离出的优势的菌种经研究后却发现这些细菌仅仅是由于培养基上能大量被培养出来，从而被高估了它们的实际含量和作用。另外，自然界中有相当的菌种(约有90%-99%)用培养基无法培养出来。因此用培养分离的方法反映发酵蔬菜体系中微生物种类和实际存在的微生物存在很大偏差。并且用微生物培养方法需要时间长，步骤繁瑣。用脂肪酸组成非培养方法分析发酵蔬菜体系中微生物多样性时鉴定区分关系较远的微生物有一定困难，其应用受到限制；碳源利用分析方法主要基于革兰氏阴性菌的鉴定，不能真实反应发酵蔬菜体系中大量微生物。而用本发明的分子生物学手段能够快捷、准确的反映发酵蔬菜中微生物多样性。
发明内容本发明的目的在于针对上述不足提供一种检测发酵蔬菜中微生物多样性的新方法，该方法避开了微生物培养分离环节，釆取直接从样品中抽取所含微生物总DNA进行分析，了解其中所包含的微生物DNA的种类，并且还可以估算各种微生物的相对含量。本发明方法包括如下步骤从样品中抽取所含微生物总DNA，以总DNA为模板，以16SrRNA基因通用引物为引物扩增16SrRNA基因，回收扩增产物并建立16SrRNA基因的克隆菌库，测定阳性克隆16SrRNA基因的序列，与基因数据库比较后确定其身份。本发明的样品可以是发酵液。所使用的通用引物可以是大肠杆菌16SrRNA上的一段。并且可以根据所要具体扩增的产物类型进一步确定引物序列。建立克隆菌库可以釆用常规的方法，将扩增产物回收，并和T载体连接后导入感受态大肠杆菌中，经选择性培养得到了16SrRNA基因的克隆菌库。在测序前可以对阳性克隆菌用PCR法进一步确认，然后再送交测序公司测序可降低成本。并且可以通过计算某一阳性克隆菌占总阳性克隆菌的比例确定该菌在发酵蔬菜体系中的相对含量。本发明方法由于直接从样品中提取DNA，中间没有任何筛选性的过程，因此，所得DNA能够准确地反映发酵蔬菜中微生物种类，避免了培养分离方法不能真实反映发酵蔬菜体系微生态实际情况的缺点，并能够对发酵蔬菜中某一微生物在发酵蔬菜体系中的含量作出评估。由于本发明方法不需要将菌种进行分离，因而可以大大缩短了检测时间。4图l是釆用常规方法的鉴定程序。具体实施例方式下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。实施例l用16SrRNA基因检测泡菜水中乳酸菌的种类及含量取四川泡菜水IO毫升，用灭菌的滤纸过滤，用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根时代公司[TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.，LTD])提取发酵蔬菜滤液中微生物总DNA,以此DNA为模板，以细菌16SrRNA基因通用引物为引物进行PCR扩增，上下游引物分别为fD1:5'國AGAGTTTGACCTCCTCCTGGCTCAG-3'rDl:5'國AAGGAGGTGATCCAGCC-3'扩增条件反应体系和反应条件分别见表1和表2。表1PCR反应体系Tab.lReactionsystemofPCR<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2PCR反应条件<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>再延伸72C10min回收扩增产物并与T载体连接，将连接产物导入感受态大肠杆菌ToPlO,用选择培养基培养，筛选阳性克隆(含有目的片断连接产物的菌落)，用PCR方法进一步确认阳性克隆，将阳性克隆测序，将测序结果分别在GenBank库中比对，结果发现在本例中共有8种乳酸菌。见表3。表3发酵菜商中乳酸菌的16SrDNA序列分析结果OrganismidentifiedNo.(%)ofUniqueclonedesignationGenBankaccession%Similarity'鉴定的微生物organism不同微生物的编号number同源性(％)identifiedGenBank登录号相对含量(％)丄a加6ocz7/wsaciaf的r/wfle14(25.46)BH>B3,B16，B26，B20，B21，DQ649012B5，B29，B30，B35，B4，B8，B36,B4097.998.7丄(3加6aa7/w51p/。她n/w20(36.36)B19，B25,B2，B6，B10，B13，DQ64卯13B27，B34,B14，Bl,B7，B18，B24,B15，B38，B39，B23，B4l，B42，B12,B2898,199.03(5.46)B44，B46DQ64901598.1~99.14(7.27)5(9.01)6(10.91)2(3.64)1(1.81)B50，B17，B6，B9DQ649014B22，B43，B51，B53，B55EF423913B31，B32，B37，B45，B47，B48EF423914B49，B52B54EF423911EF42390898.599.298.699.998.6-99.098.399.2*克隆菌16SrRNA基因序列同GenBank库中比对后的同源程度用常规方法检测发酵蔬菜体系中乳酸菌多样性的方法步骤:1.发酵菜卤中乳酸菌的分离分离乳酸菌是用MRS和M17培养基。MRS琼脂用于分离乳酸杆菌，明串珠菌和足球菌属的乳酸菌。M17用于分离乳球菌属和肠球菌。将发酵菜卤稀释(105、106、10。后接种的MRS,M17平板在3(TC厌氧培养48时。从不同的高浓度平板中随机挑取菌落转移到装有无菌MRS和M17肉汤培养基的10ml试管中，进行种属鉴定之前将分离的菌落在适宜的琼脂培养基上用连续划线方法纯化。共103株纯化的菌。2发酵菜卣中乳酸菌的鉴定程序及实验项目鉴定程序可参照图l进行，实验项目包括1)革兰氏反应试验2)触酶反应试验3)葡萄糖产气实验4)温度和盐浓度对微生物的影响通过上面的性质实验把乳酸菌归类，从同一类型选取几株为代表用API50CH试剂条和API50CHL培养基进行碳源利用实验，并用软件作出鉴定结果。3.分离的乳酸菌的鉴定到属的水平应用API50CH试剂条和API50CHL培养基按照厂商(APIsystem，Bio-Merieux,France)的指示说明对分离的30菌株(每类取5株)进行糖发酵反应，试验结果由APILABPLUS(Version3.3.3，Bio画Merieux，France)程序和标准分类法描述。API50CH试剂条成份见下表表4API50CH试剂条成份Table4ReagentcomponentofAP150CH碳源_对照25七叶灵1甘油26柳醇2赤癣醇27纤维二糖3D—阿拉伯糖28麦芽糖4L-阿拉伯糖29乳糖7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实验结果:表5发酵菜卤中iL酸菌的表型鉴定试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>两种方法的分析比较l.常规方法的实验时间为三个月左右，用本发明方法只需一周就可完成.检测时间缩短了约13倍。2.用常规方法鉴定的乳酸菌有六种，分别为Z^cto6""7/^/acrics。其中丄acto6acz7/z^//朋torwm的含量最多，为分离总乳酸菌的34.44%，其)大是Z^cfo6acz7/Ms尸ew^wiw和丄flcA9Zjac/〃Ms6rev^，分另l)为30%和27.78%，Zflcto6ac7.〃z^y^7wewrt/m、丄ewco"ostoc附esew&ro/das、丄ac/oZac7.〃ws/ad'cs的含量少.3.用本发明方法鉴定的乳酸菌有八种，分别为丄"Ctok7C/〃Mac/dz》W"ae(25.46^)、丄"Co6(afc;/〃Ms//aw^^Mm(36.36%)、尸ed/ococcws>sp.(5.46%)、ffe^se〃aco"ykya(7.27%)丄acto6ac/〃ws/ewtosws(9.01M)、丄aCo6acz.〃wscwrw^M51(10.91^0)、丄ewcowastocw&sewterozVifes(3.64%)、丄acto6a"7/ws/^附附&7(1.81%)。其中Za"o6ac/〃附//awtoram的含量最多。这和常规检测方法的结果一致，其次为Z^cto6""7/w<ac/(ii/^n>2(3e(25.46%),此菌和尸Wococcws>sp.(5.46%)、,&e〃aco"yksa(7.27%)、丄ac^o6ac/〃MSci^va^^(10.91%)、丄acfoZ)ac/〃MS/2"wmewY(1.81%)是用常规方法未检测到的乳酸菌。而常规方法检测/""/^用本方法未检测到，可能和培养基的成分适应这些菌的生长以及对菌的识别的差异有关。本发明未涉及培养基的配制和人为识别菌的其他实验，因此反应发酵菜中乳酸菌的多样性是真实的，并能够对某一菌的含量做出正确的估计。参考文献1、邱致广.酸菜腌制过程中微生物与风味物质的变化[博士学位论文].台湾国立中兴大学食品科学研究所，19932、LeeJ.S.,JungM.C.，LeeK.C.，"a/,.IdentificationoflacticacidbacteriafromkimchibycellularFAMEsanalysis.KoreanJournalofAppliedMicrobiologyandBiotechnology,1996a,24:234~2413、LeeJ.S.,ChunC.O.,Kim,H.J.,"or/.AnalysisofcellularfattyacidmethylestersFAMEs.FortheidentificationofZewcowo加cstrainsisolatedfromkimchi.JournalofMicrobiology,1996b，34:225~2284、LeeJ.S.,ChunC.O.，JungM.C.，Wa/..Classificationofisolatesoriginationgfromkimchiusingcarbon-sourceutilizationpatterns.JournalofMicrobiologyandBiotechnology,1997a,7:68~745、LeeJ.S.，ChunC.O.，HectorM.，"a/..IdentificationofLeuconostocstrainsisolatedfromkimchiusingcarbon-sourceutilizationpatterns.JournalofMicrobiology,1997b,35:10~1权利要求1、一种检测发酵蔬菜中微生物多样性的方法，包括步骤从样品中抽取所含微生物的总DNA，以总DNA为模板，以16SrRNA基因通用引物为引物扩增16SrRNA基因，回收扩增产物并建立16SrRNA基因的克隆菌库，测定阳性克隆16SrRNA基因的序列，与基因数据库比较后确定其身份。2、如权利要求l所述的方法，其特征在于，该方法还包括通过计算某一阳性克隆菌占总阳性克隆菌的比例确定该菌在发酵蔬菜体系中的相对含量。3、如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的通用引物为细菌16sRNA基因通用引物。4、如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的通用引物为fD1:5'國AGAGTTTGACCTCCTCCTGGCTCAG-3'rDl:5'-AAGGAGGTGATCCAGCC扁3'。5、如权利l或2所述的方法，其特征在于，将扩增产物回收后，与T载体连接，并导入感受态大肠杆菌中，经选择性培养得到16SrRNA基因的克隆菌库。6、如权利要求l或2所述的方法，其特征在于，在测序前还包括对阳性克隆菌用PCR法进一步确认。全文摘要本发明提供了一种检测发酵蔬菜中微生物多样性的方法，本发明方法直接从样品中抽取所含微生物的总DNA，通过对16SrRNA基因的序列分析，从而确定样品中微生物的种类。本发明方法由于直接从样品中提取DNA，中间没有任何筛选性的过程，因此，所得DNA能够准确地反映发酵蔬菜中微生物种类，避免了培养分离方法不能真实反映发酵蔬菜体系微生态实际情况的缺点，并能够对发酵蔬菜中某一微生物在发酵蔬菜体系中的相对含量作出评估。由于本发明方法不需要将菌种进行分离，因而可以大大缩短了检测时间。文档编号C12Q1/06GK101445822SQ200810102760公开日2009年6月3日申请日期2008年3月26日优先权日2008年3月26日发明者惠张,燕平梅,薛文通申请人:中国农业大学