专利名称：用磷脂脂肪酸谱图技术分析土壤微生物群落的多样性的制作方法
技术领域：
磷脂脂肪酸谱图(PLFA)分析技术是一种研究微生物生态的生物化学方法，主要用于微生物群落的生物量、群落结构、营养状况和新陈代谢活动等方面的研究。此外，在进化和分类学研究中，该方法也被证明十分有效。
背景技术：
目前对于土壤的描述主要采用一些理化指标，很少涉及土壤微生物的状况。实际上，土壤中微生物的生物量占土壤总生物量(除去植物的根)的80％，很大程度上决定着土壤的生态功能。土壤微生物几乎对所有植物营养元素的代谢、循环都起重要的作用，并且与土壤的有机质含量和肥力密切相关。因此，土壤中微生物的多样性常被作为评价土壤质量的生物学指标，可以提供关于土壤质量的有用信息，从而更准确、全面的评价土壤生态。
但是，大多数的土壤微生物是不可培养的。通过以纯培养为基础的传统方法分离鉴定到的微生物占环境微生物总数的0.1-10％，只能提供微生物群落信息的一小部分。
PLFA分析技术可以克服以纯培养为基础的传统方法的局限性，能够更加全面、准确的描述土壤微生物群落。使用它不但能够得到比较完整的微生物群落信息(包括不可培养的那部分微生物)，而且具有快速、准确等特点。其原理是基于磷脂几乎是所有生物细胞膜的重要组成部分，细胞中磷脂的含量在自然条件下(正常的生理条件下)恒定，其长链脂肪酸的形式——磷脂脂肪酸可作为微生物的标记物。此外，磷脂不能作为细胞的贮存物质，在细胞死亡后会很快降解，可以代表微生物群落中“存活”的那部分群体。不同菌群的PLFA特征谱图不同，在高度专一性基础上具有多样性，可以作为微生物群落中不同群体的标记物。
多样性指数(H)，丰度(S)和均匀度(EH)等指标被用来反映多样性的状况。
虽然大家都已公认，可以使用PLFA谱图分析技术研究土壤微生物群落，但是具体的利用PLFA谱图来计算土壤微生物群落的多样性还未见报道，本研究基于这方面，提出了一种新的土壤微生物群落多样性的计算方法，即以PLFA谱图为基础的计算方法。
发明内容
从土壤样品中提取脂质，经过硅酸柱分离出极性脂质。再将得到的分离物在碱性环境下进行甲酯化反应，得到脂肪酸甲酯。将脂肪酸甲酯溶于含有内标物正十九烷脂肪酸甲酯(nonadecanoic acid methyl ester)的氯仿∶正己烷(1∶4)溶剂中，使用气相色谱-质谱联用仪进行分析，最后能够得到不同种类磷脂脂肪酸的含量。根据土壤样品中不同种类磷脂脂肪酸的含量可以计算出多样性指数，反映土壤微生物群落的多样性状况。
因为不同菌群的PLFA特征谱图不同，在高度专一性基础上具有多样性，可以作为微生物群落中不同群体的标记物，所以样品中以不同种类磷脂脂肪酸含量为基础计算的多样性指数能够反映土壤微生物生态的多样性。PLFA谱图提供的是土壤中活菌落的信息，且不但包含可培养的微生物，还包括不可培养的那部分微生物，因此计算得到的PLFA多样性指数反映的土壤中整个“存活”微生物群落的多样性状况。
这一发明对研究微生物群落多样性和相关研究，特别是对准确评价农田生态、并对其将来的发展进行预测具有十分重要的实际意义，提供了准确、快速的手段。
具体实施例方式称量4g的土壤样品，加入3.6ml的磷酸盐缓冲液、4ml氯仿和8ml甲醇，避光振荡1小时后以2000rpm的速度离心30min。上清液转移到50ml分液体漏斗中，再加入3.6ml磷酸盐缓冲液和4ml氯仿，室温下避光过夜分离。收集下层的氯仿相，使用硅酸柱进行分离，分别用5ml氯仿、10ml丙酮和5ml甲醇作为洗脱液。收集甲醇相，使用高纯氮气吹干，再加入1ml甲醇∶甲苯(1∶1，V∶V)和1ml 0.56％(w/v)KOH的甲醇溶液，于35℃下反应30分钟。冷却至室温，加入醋酸中和，再加入2ml氯仿∶正己烷(1∶4，V∶V)和超纯水混合。静置分层后收集上层液体，使用高纯氮气吹干，再溶于含有一定量内标十九烷酸甲基酯(nonadecanoicacid methyl ester)的氯仿∶正己烷(1∶4，V∶V)溶剂中。
使用安捷伦公司的气相色谱-质谱联用仪对含有内标物的样品提取液进行分析，升温程序如下进样后在50℃保持1min，之后以12℃ min-1的速率升至180℃，保持2min后以6℃min-1的速率上升到220℃，停留2min后以15℃ min-1的速率上升到240℃，保持1分钟后以15℃ min-1的速率达到最终温度260℃，并在此保持15min。气谱与质谱之间的连接温度为280℃，用高纯氦气(1ml min-1)作为载气。质谱仪采用电子电离(EI)方式，电子能量为70ev。
根据质谱图和标准库比对识别磷脂脂肪酸，然后用内标法计算出每种磷脂脂肪酸的含量，再换算成摩尔百分含量。据此计算多样性指数(H)，计算公式如下H=-Σi=1Spilnpi=-Σi=1S(Ni/N)ln(Ni/N)]]>其中，pi是样品中某一PLFA的摩尔百分含量，S是某个土壤样品中所有PLFA种类的数目。下表为采集自我国6个不同地区土壤样品微生物群落的多样性指标。
表以PLFA为基础计算中国不同地区土壤微生物群落的多样性指标Soil Shannon-Wiener indexRichnessEvenness(H)(S) (EH)福建4.08627 0.86辽宁3.59923 0.80陕西4.02225 0.87新疆4.17128 0.87四川4.06824 0.89河北4.16524 0.9权利要求
1一种分析土壤样品微生物群落多样性的方法，包括以下步骤a)选择用于实验的土壤材料；b)称量一定量步骤a)中的土壤材料，加入缓冲液和有机溶剂，获得含有脂质的有机相；c)将步骤b)获得的有机相经过硅酸柱分离，分别用不同的有机溶剂洗脱，收集含有极性脂质的洗脱液；d)将步骤c)获得的含有极性脂质的洗脱液在碱性环境下进行甲酯化反应；e)将步骤d)得到的溶液与有机溶剂混合，提取有机相；f)将步骤e)得到的有机相用高纯氮气吹干，提取到含有一定量内标的有机溶剂中；g)使用气相色谱-质谱联用仪定量分析步骤f)中得到的溶液，分析得到样品中不同种类磷脂脂肪酸的含量；h)使用步骤g)中得到的数据，计算多样性指数，判断土壤样品微生物群落的多样性情况。
2权利要求1的方法，其中步骤a)中的实验材料可以为任意地点和不同类型的土壤，本实验选用的是新疆、河北、陕西、四川、辽宁和福建的农田土壤。
3权利要求1的方法，其中步骤b)中称量的是4克土壤样品，加入的是3.6ml磷酸盐缓冲液、4ml氯仿和8ml甲醇溶剂。
4权利要求1的方法，其中步骤c)中使用的洗脱液分别为5ml氯仿、10ml丙酮和5ml甲醇溶剂，收集甲醇的洗脱液。
5权利要求1的方法，其中步骤d)中加入的溶剂是1ml甲醇∶甲苯(1∶1，V∶V)和1ml 0.56％(w/v)KOH的干甲醇，将溶液于35℃下反应30分钟。
6权利要求1的方法，其中步骤e)中加入有机溶剂为氯仿∶正己烷(1∶4，V∶V)2ml。
7权利要求1的方法，其中步骤f)中的内标为十九烷酸甲基酯(nonadecanoic acid methylester)，有机溶剂为氯仿∶正己烷(1∶4，V∶V)。
8权利要求1的方法，其中步骤g)中的气相色谱-质谱联用仪采用的是HP6890气相色谱-HP5973质谱联用仪，检测中使用的升温程序如下进样后在50℃保持1min，之后以12℃min-1的速率升至180℃，保持2min后以6℃min-1的速率上升到220℃，停留2min后以15℃min-1的速率上升到240℃，保持1分钟后以15℃min-1的速率达到最终温度260℃，并在此保持15min。气谱与质谱之间的连接温度为280℃，用高纯氦气(1ml min-1)作为载气。质谱仪采用电子电离(EI)方式，电子能量为70ev。
9权利要求1的方法，其中步骤h)中多样性指数(H)，计算公式如下H=-Σi=1Spilnpi=-Σi=1S(Ni/N)ln(Ni/N)]]>其中，pi是样品中某一PLFA的摩尔百分含量，S是某个土壤样品中所有PLFA种类的数目。
10权利要求1的方法，其中步骤h)中判断不同土壤样品中微生物群落多样性状况的方法为多样性指数越大，说明土壤微生物群落的多样性越丰富，反之越差。
全文摘要
本发明涉及一种用于分析土壤微生物群落多样性的生物化学方法，即用磷脂脂肪酸谱图技术分析土壤微生物群落的多样性。具体步骤如下1)称量一定量的土壤材料；2)加入缓冲液和有机溶剂，获得含有脂质的有机相；3)有机相经硅酸柱分离，收集含有极性脂质的洗脱液；4)收集的洗脱液在碱性环境下进行甲酯化反应，得到脂肪酸甲酯；5)使用气相色谱－质谱联用仪定量分析脂肪酸甲酯，得到样品中不同种类磷脂脂肪酸的含量；6)计算多样性指数，判断土壤微生物群落的多样性情况。这一发明对研究微生物群落多样性及相关研究，特别是对准确评价农田生态、并对其将来的发展进行预测具有十分重要的实际意义，提供了准确、快速的手段。
文档编号G01N30/88GK1588048SQ200410062448
公开日2005年3月2日 申请日期2004年7月9日 优先权日2004年7月9日
发明者齐鸿雁, 薛凯, 张洪勋, 罗海峰 申请人:中国科学院生态环境研究中心