专利名称：一种检测土壤微生物多样性的分析方法
技术领域：
本发明涉及一种生物分析的方法，尤其涉及一种检测土壤微生物多样性的分析方法。
背景技术：
目前，对土壤微生物的研究主要是借助了分子生物学的手段，直接从土壤中获得微生物的宏基因组DNA进行分析，该策略使环境微生物多样性分析成为一种尽可能全面的方法。近年来，关于土壤宏基因组DNA提取方法的报道很多。然而主要侧重于提取土壤中细菌群落的总DNA的提取，较少关注土壤中真菌群落总DNA的提取及其提取效果。来自环境中的样品含有非常复杂的成分，尤其是土壤中的腐质酸类物质在提取过程中不能去除掉， 直接影响后续的PCR扩增。所以大多数方法初提的DNA都要经过回收纯化，然而回收的过程或多或少的会损失部分DNA，尤其是大片段的DNA回收率比较低，有人利用通过透析袋回收纯化，纯化回收率只能够达到65. 34%，仍然丧失了一部DNA，对于实际上存在量本来就少的微生物种类后续的检测中就很难检测到，因而不能真实地反土壤微生态结构。因此，如何减少提取以后的DNA损失是有待于解决的问题。
发明内容
本发明为了解决以上的问题而提出一种检测结果清确度高的检测土壤微生物多样性的分析方法，其技术方案如下一种检测土壤微生物多样性的分析方法，包括以下步骤(1)从土壤中进行DNA提取；(2)对步骤(1)中的DNA提取液中测出土壤中的DNA的浓度和纯度；(3)将土壤中提取的DNA进行PCR特异性扩增；(4)PCR反应产物的变性梯度凝胶电泳分析。如上所述的一种检测土壤微生物多样性的分析方法，其中提取DNA的条件如下 称土样于离心管中，加提取液涡旋混勻后置于冰箱静止或液氮速冻，取出水浴融化，反复冻融，加蛋白酶K，摇床振荡，加SDS，水浴在室温离心，收集上清，尽可能的不要取到上清与土壤沉淀之间的杂质，沉淀加提取液和20% SDS，涡旋水浴一定的时间，室温下离心，合并上清；上清中加聚己二醇800混勻，沉淀过夜；然后离心，弃上清，沉淀加入IXTE溶解；用等体积的氯仿异戊醇抽提，离心后收集上清，重复一次；用NaAc和异丙醇室温沉淀，离心后弃上清；沉淀用70%乙醇洗涤，离心后弃上清，晾干，加超纯水溶解。如上所述的一种检测土壤微生物多样性的分析方法，其中步骤O)中的检测方法为取所提取的DNA，0.7%琼脂糖检测，以λ mixl9 (i^rmentas)为Maker，用紫外分光光度计测定DNA的0D26Q、OD230> OD260/OD230的值及DNA的纯度。如上所述的一种检测土壤微生物多样性的分析方法，其中在步骤(3)中的PCR仪反应条件为反应总体积为20 μ L 模板DNA lng, PCR buffer 2 μ L，Mg2+2 μ L，引物(10 μ Μ)各 0. 2 μ L，BSA (10mg/mL) 2 μ L, dNTPs (各 IOmM) 0. 3L, Taq 酶(5U/L) 0. 2 μ L, ddH20 补齐至 20 μ L。长片段扩增应程序94% 4min ；94°C 40S，46°C 40S，72°C 40S，共循环 38 次 72°C延伸 IOmin ；4°C保存；取上述的一次扩增产物1 μ L，PCR buffer 5 μ L，Mg2+5 μ L，弓丨物(10 μ Μ)各 0. 5μ L, dNTPs (各 IOmM) 0. 7 μ L, BSA (10mg/mL) 2 μ L, Taq 酶(5U/ μ L) 1 μ L, ddH20 补齐至 50μ L。采用降落式 PCR 反应程序94°C 4min ；94°C 30S，63°C 30S，72°C 30S，共循环 15 次；94°C 30S,63°C 30S(每循环 1 次下降 1)，72°C 30S，共循环 13 次；94°C 30S,52°C 30S, 72°C 30S ；72°C延伸7min ；4°C保存。扩增产物利用1 %的琼脂糖凝胶电泳检测，DL2000作为 Marker ；细菌16SrDNA 的扩增引物 F27 5 ‘ -AGAGTTTGATCMTGGCTCA-3 ‘ ；R1522
5‘ -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 ‘，再利用 V3 区的引物 F357-GC 5 ‘ -CGCCCGCCGCGCGCGGCG GGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3 ‘和 R518 :5 ‘ -ATTACCGCGGCTGCTGG-3 ‘ 扩增 V3 区；真菌 18SrDNA 的扩增引物为 Geoll 5' -CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3‘，Geo2 5' -ACCTTGTTACGACTrrrrACTTCC-3‘；扩增其中片段用 NS1-GC :5‘ -CGCCCGCCGCGCGCGGGC GGGGCGGGGGCACCGGCCAGTAGTCATATGCTTGTC-3' , NS2 5' -GGCTGCTGGCACCAGACTTGC-3‘。如上所述的一种检测土壤微生物多样性的分析方法，其中所述的提取液由以下组份组成:0. Imol Tris,0. Imol EDTA，0. Imol 磷酸缓冲液，1. 5mol NaCl, 1% CTAB, ρΗ8· O。如上所述的一种检测土壤微生物多样性的分析方法，其中所述的土壤为盐土或碱性土壤。如上所述的一种检测土壤微生物多样性的分析方法，其中在步骤中的变性梯度凝胶电泳分析采用的基因突变检测系统对PCR反应产物进行分离，分别用浓度为10%，
6%的丙稀酰胺，变性剂范围为30 % 60 %，电泳150V，6h，EB染色15min后，凝胶成像系统，观察拍照。利用本发明的方法对各种土壤进行的检测分析，其结果最接近真实的微生物状态。因为在处理的过程中，提取的DNA溶液无损失，对研究土壤中的微生物提供了完美的解决方法。
图1为四种不种质地的土壤总DNA的琼指糖凝胶检测；1.药用植物根际土，2.罗布泊湖盐土，3.胡杨根际土，4.棉田土壤。图2为16S rDNA V3区的扩增结果和18S rDNA的扩增结果；1、5为药用植物根际土，2、6罗布泊湖盐土，3、7胡杨根际土，4、8棉田土壤。图3为16S rDNA的DGGE检测结果；1.药用植物根际土，2.罗布泊湖盐土，3.胡杨根际土，4.棉田土壤。图4为18S rDNA的DGGE检测结果；1.药用植物根际土，2.罗布泊湖盐土，3.胡杨根际土，4.棉田土壤。
具体实施例方式下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细解释
4
实施例1，土壤DNA的提取称0. 5g四川省螺髻县的药用植物根际土(其pH值为4. 30) 土样于2ml离心管中，加1. 3ml提取液(0. Imol Tris, 0. Imol EDTA，0. Imol磷酸缓冲液， 1. 5mol NaCl, 1% CTAB，pH8. 0)涡旋混勻后置于_80°C冰箱静止30min (或液氮速冻5min)， 取出于65%水浴融化，反复冻融3次；加100 μ L蛋白酶K (lmg/ml)，37°C摇床振荡30min，加 200 μ L浓度为20%的SDS，65°C水浴2h (期间每15 20min轻轻颠倒混勻)，室温6000r/ min离心lOmin，收集上清，尽可能的不要取到上清与土壤沉淀之间的杂质；沉淀加0. 75ml 提取液和 50μ L20% SDSji^m 10s65°C水浴 lOmin，室温 6000r/min 离心 lOmin，合并上清； 上清中加0. 5倍体积的聚己二醇800 (50% PEG, 1. 5molNaCl)混勻，沉淀过夜；600r/min离心30min，弃上清，沉淀加入0.5ml 1 X TE溶解；用等体积的氯仿异戊醇Q4 1)抽提， 40C 12000r/min离心20min收集上清，重复一次；用0. 1倍体积NaAc (3mol/L)和0. 6倍体积异丙醇(_20°C预冷)室温沉淀4h，4°C，12000r/min离心20min弃上清；沉淀用70%乙醇洗涤，4V，12000r/min离心20min弃上清，晾干；加50 μ L超纯水溶解。土壤DNA浓度及纯度的检测取5 μ L所提取的DNA，0. 7 %琼脂糖检测，以 λ mixl9 (Fermentas)为 Maker，用紫外分光光度计(BioPhotometer 6131，Eppendoff)测定DNA的0D26(1、0D23(1、0D26(1/0D23(1的值及DNA的纯度，测定时DNA稀释了 10倍，所提土样量为 0. 5g，最终换算成每克土壤中所提DNA的量。土壤DNA的PCR反应利用细菌的16SrDNA和真菌的18SrDNA特异引物分析土壤中细菌和真菌DNA的提取质量。细菌16SrDNA的扩增引物F27 5 ‘ -AGAGTTTGATCMTGGCTCA-3 ‘ ；R1522 5 ‘ -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 ‘，再利用 V3 区的引物 F357-GC 5 ‘ -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCA G-3'和 R518:5' -ATTACCGCGGCTGCTGG-3‘扩增 V3 区；真菌 18SrDNA 的扩增引物为 Geoll 5' -CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3 ‘ , Geo2 5 ‘ -ACCTTGTTACGACTrrrrACTTCC-3 ‘；扩增其中片段用 NSl-GC :5 ‘ -CGCCCGCCGCGCGCGGGCGGGGCGGGGGCACCGGCCAGTAGTCATATGCTTGT C-3' ,NS2 5' -GGCTGCTGGCACCAGACTTGC-3 ‘进行。二次扩增的引物前均加GC夹子，便于后续的DGGE分析。长片段PCR反应体系及程序扩增反应在BioRad公司生产的Mycycle PCR仪中进行，反应总体积为 20 μ L 模板 DNA lng, PCR buffer 2 μ L，Mg2+2 μ L，引物(10 μ Μ)各 0. 2 μ L，BSA (10mg/mL) 2 μ L, dNTPs (各 IOmM) 0. 3L, Taq 酶(5U/L) 0. 2 μ L, ddH20 补齐至 20 μ L。长片段扩增应程序94% 4min ；94°C 40S，46°C 40S，72°C 40S，共循环 38 次 72°C延伸 IOmin ；4°C保存。PCR 二次扩增反应体系取一次扩增产物1 μ L，PCR buffer 5 μ L，Mg2+5 μ L，引物 (10 μ Μ)各 O. 5 μ L，dNTPs (各 IOmM) 0. 7 μ L, BSA (10mg/mL) 2 μ L, Taq 酶(5U/ μ L) 1 μ L, ddH20 补齐至50 μ L。采用降落式PCR反应程序94°C 4min ；94°C 30S，63°C 30S，72°C 30S，共循环 15 次；94°C 30S，63°C 30S(每循环 1 次下降 1)，72°C 30S，共循环 13 次；94°C 30S，52°C 30S, 72°C 30S ；72°C延伸7min ；4°C保存。扩增产物利用1 %的琼脂糖凝胶电泳检测，DL2000作为 Marker0PCR反应产物的变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析采用Bio-Rad公司Dcode的基因突变检测系统对PCR反应产物进行分离。分别用浓度为10%，6%的丙稀酰胺，变性剂范围为30% 60%。电泳150V，6h。EB染色15min 后，凝胶成像系统(BioRad, Gel Doc 2000)观察拍照。实施例2 本实施例中的土样取自新疆罗布泊湖的盐土，其pH为6. 96，其土壤DNA的提取、土壤DNA浓度及纯度的检测、土壤DNA的PCR反应、PCR反应产物的变性梯度凝胶电泳(DGGE) 分析方法同实施例1。实施例3 本实施例中的土样取自新疆塔里木河岸的胡杨根际土，其pH为8. 64，其土壤DNA 的提取、土壤DNA浓度及纯度的检测、土壤DNA的PCR反应、PCR反应产物的变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析方法同实施例1。实施例4 本实施例中的土样取自新疆阿克苏的棉田土，其pH为7. 60，其土壤DNA的提取、土壤DNA浓度及纯度的检测、土壤DNA的PCR反应、PCR反应产物的变性梯度凝胶电泳(DGGE) 分析方法同实施例1。上述的四种土壤检测实施例DNA的提取效果用上述实施例方法提取4种不同性质的土壤均能提取出DNA如图1，其不同的土壤，药用植物根际土、盐土、胡杨根际土和棉田土编号分别为1、2、3和4，片段在23kb以上， 与国内外土壤微生物的提取片断大小吻合。在酸性土壤中有略微拖尾现象，其他的3类土壤中不存在拖尾现象。腐殖酸在230Am处有吸收峰，通过估算OD26tZOD23tl值来确定所提取的 DNA中腐殖酸的污染程度OD26tlAD23tl值越高，表明DNA纯度越纯，反之，腐殖酸污染越严重。 用此方法所提的DNA的比值在0. 89 1. 23之间，如表一所示，从酸性土壤提取的DNA的OD 较低，而在盐渍土壤和碱性土壤中提取的DNA的OD比值高一些，表明此方法更适合于提取盐渍土壤和碱性土壤的DNA。每Ig 土壤中，所提取的DNA的从3. 74 15. 28g,从罗布泊盐碱土壤中提出的量最少，可能与此种土壤中本身生物量较少有关。虽然比值低于理想值，此纯度能够满足后续分析的需要。表一四种土壤总DNA的提取量和纯度。
样品编号OD230D260OD230/D260DNA的浓度 (ug/g)每克土壤DNA的量 (wg/g)10.4430.3940.8978.87.8820.1580.1881.1937.43.7430.6100.7141.17142.814.2840.6320.7651.21152.815.28PCR的琼脂糖凝胶检测结果和DGGE检测结果。
利用细菌的16SrDNA和真菌的18S rDNA的特异引物对所提取的4种性质的土壤进行PCR扩增，均获得较强的扩增结果，如图2所示。16S rDNA V3区的扩增的目标片段为 230bp左右，对18S rDNA的扩增在550bp左右，在胡杨根际土和棉田土壤中的扩增条带更亮些，说明在这两个样品中的扩增更强一些。DGGE图谱条带的丰富性和亮弱程度可以反应土壤的微生物的多样性和优势种类、特殊种类，可利用DGGE技术分析评价该方法所提DNA 的全面性。图3为土壤细菌的DGGE图谱，细菌的条带数达到40条以上，并且优势种条带明显，条带集中于整个凝胶的中间部分。图4为土壤真菌的DGGE图谱，真菌的条带数达到30 条以上，优势种条带明显。分析表明细菌的丰富性较真菌多，不同性质的土壤中真菌之间的相似性较细菌之问的相似性小，条带集中于整个凝胶的中间部分，显示真菌、细菌均存在较丰富的多样性。此方法能够较为灵敏、全面的反应土壤微生物的多样性，也说明所提DNA较为全面。结论目前提取土壤DNA的方法主要有直接提取法和间接提取法，间接提取纯度较高，但提取的种类和数量较少；直接提取法是直接在土壤中裂解细胞，使其中内含物尽可能的释放，能够代表大部分的土著微生物。但是由于土壤中所含物质种类较多，量较大，因而提取的质量受到很大的影响，许多方法需要对粗体DNA做纯化处理，常用的氯化铯密度梯度超速离心、电泳法、过滤法、试剂盒法。回收纯化后往往造成部分DNA的丧失，可能在土壤中本身存在量较少的种类会丧失或检测不到，影响土壤微生物多样性的分析。本方法中大量样品提取改为小量样品的提取，样品加入裂解液后_80°C冰箱(或液氮)与65°C反复冻融，利于细胞壁较厚的微生物充分破壁，使细胞含物的充分释放，在DNA沉淀的过程中采用聚乙二醇(PEG8000)。沉淀DNA分子所用的PEG的浓度也不同，沉淀大片段DNA分子所需 PEG的浓度只需1 %左右，小片段DNA分子所需PEG浓度高达20%。本实施例中加入终浓度为17% PEG进行沉淀，获得较好的沉淀效果另外，有人用PEG沉淀结合碱裂解法提取DNA 可消除肝素对PCR检测结果的影响DNA，这可能也是本方法不用回收纯化而获得较好质量 DNA的一个原因。目前对于土壤DNA的提取质量方面，一般认为所提取的片段在231Λ以上即可，有人报道每克土壤中所提DNA的量在2. 5 31 μ g之间，本方法所提大小在231Λ以上，DNA的提取量每克土壤中所提取的DNA的从3. 74 15. 28g获得较稳定的提取量。从土壤中尽可能的提取出所有种类微生物的DNA是进行土壤微生态分析的基础，也是充分发应土壤微生物多样性的必备条件。提取土壤DNA进行微生物多样性分析的一个重要的环节在于是否能够进行PCR扩增。土壤中存在大量的PCR反应抑制剂，如腐殖酸、腐殖酸类似物， 重金属离子等，有人提取粗DNA不经过纯化，就无法获得PCR产物。本方法不经过纯化直接进行PCR反应，通过两次PCR，细菌16S rDNA特异引物及真菌18rDNA核糖体DNA特异引物均获得较好的扩增结果。PCR过程中发现，加入BSA PCR有一定的影响，可能由于本方法不做回收纯化，而土壤中有些不确定的物质残留到PCR体系中，从而影响Taq酶的活性，加入了 BSA对Taq酶有一定的保护作用从而达到更好的扩增效果。PCR分析中发现，此方法提取的宏基因组DNA不但能够扩增原核生物的特异基因，也能扩增真菌的特异基因，表明该方法能从土壤中同时有效提取细菌和真菌总基因组DNA，DGGE分析结果显示，土壤细菌和真菌均表现出较高的多样性，代表了较丰富的类群。本方法不但适于分析土壤细菌群落结构， 同时也可用于分析真菌等真核微生物的多样性。本方法从4种不同性质的土壤中均有效地提取到DNA，在酸性土壤提取的DNA的杂质残留较多，与土壤偏酸性有关系，其DNA提取融解液的颜色深，色素残留较多，但是并不影响后续的PCR及DGGE分析；从盐土及碱性土壤中所提的DNA的质量较高，说明该方法更适合于盐碱土壤DNA的提取。
权利要求
1.一种检测土壤微生物多样性的分析方法，包括以下步骤(1)从土壤中进行DNA提取；(2)对步骤(1)中的DNA提取液中测出土壤中的DNA的浓度和纯度；(3)将土壤中提取的DNA进行PCR特异性扩增；(4)PCR反应产物的变性梯度凝胶电泳分析。
2.如权利要求1中所述的一种检测土壤微生物多样性的分析方法，其特征在于，提取 DNA的条件如下称土样于离心管中，加提取液涡旋混勻后置于冰箱静止或液氮速冻，取出水浴融化，反复冻融，加蛋白酶K，摇床振荡，加SDS，水浴在室温离心，收集上清，尽可能的不要取到上清与土壤沉淀之间的杂质，沉淀加提取液和20% SDS，涡旋水浴一定的时间，室温下离心，合并上清；上清中加聚己二醇800混勻，沉淀过夜；然后离心，弃上清，沉淀加入 IXTE溶解；用等体积的氯仿异戊醇抽提，离心后收集上清，重复一次；用NaAc和异丙醇室温沉淀，离心后弃上清；沉淀用70%乙醇洗涤，离心后弃上清，晾干，加超纯水溶解。
3.如权利要求1中所述的一种检测土壤微生物多样性的分析方法，其特征在于，步骤O)中的检测方法为取所提取的DNA，0. 7%琼脂糖检测，以λ mixl9 (i^rmentas)为 Maker，用紫外分光光度计测定DNA的0D26(1、OD230> OD260/OD230的值及DNA的纯度。
4.如权利要求1中所述的一种检测土壤微生物多样性的分析方法，其特征在于，在步骤(3)中的PCR仪反应条件为反应总体积为20 μ L 模板DNA lng, PCR buffer 2 μ L， Mg2+2yL，弓丨物(10 μ Μ)各 0.2 μ L，BSA(10mg/mL) 2 μ L, dNTPs (各 IOmM) 0. 3L, Taq 酶(5U/ L) 0. 2 μ L，ddH20 补齐至 20 μ L。长片段扩增应程序94 % 4min ；94 "C 40S, 46 "C 40S， 720C 40S，共循环38次72°C延伸IOmin ；4°C保存；取上述的一次扩增产物 1 μ L，PCR buffer 5 μ L，Mg2+5 μ L，引物(10 μ Μ)各 0. 5 μ L， dNTPs (各 10mM)0. 7μ L，BSA(10mg/mL)2y L，Taq 酶(5U/μ L) 1 μ L，ddH20 补齐至 50 μ L。采用降落式 PCR 反应程序94°C 4min ；94°C 30S，63°C 30S，72°C 30S，共循环 15 次；94°C 30S， 63°C 30S(每循环 1 次下降 1)，72°C 30S，共循环 13 次；94°C 30S，52°C 30S，72°C 30S ；72°C 延伸7min ；4°C保存。扩增产物利用1 %的琼脂糖凝胶电泳检测，DL2000作为Marker ；细菌 16SrDNA 的扩增弓丨物 F27 :5 ‘ -AGAGTTTGATCMTGGCTCA-3 ‘ ；R1522 5 ‘ -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 ‘，再利用 V3 区的引物 F357-GC 5 ‘ -CGCCCGCCGCGCGCGGCG GGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3 ‘和 R518 :5 ‘ -ATTACCGCGGCTGCTGG-3 ‘ 扩增 V3 区；真菌 18SrDNA 的扩增引物为 Geoll 5' -CCAGTAGTCATATGCTTGTCTC-3‘，Geo2 5' -ACCTTGTTACGACTrrrrACTTCC-3‘；扩增其中片段用 NS1-GC :5‘ -CGCCCGCCGCGCGCGGGC GGGGCGGGGGCACCGGCCAGTAGTCATATGCTTGTC-3' , NS2 5' -GGCTGCTGGCACCAGACTTGC-3‘。
5.如权利要求1所述的一种检测土壤微生物多样性的分析方法，其特征在于，所述的提取液由以下组份组成0. ImolTris,0. Imol EDTA，0. Imol磷酸缓冲液，1. 5molNaCl,l% CTAB, pH 为 8. O。
6.如权利要求1所述的一种检测土壤微生物多样性的分析方法，其特征在于所述的土壤为盐土或碱性土壤。
7.如权利要求2中所述的一种检测土壤微生物多样性的分析方法，其特征在于在步骤中的变性梯度凝胶电泳分析采用的基因突变检测系统对PCR反应产物进行分离，分别用浓度为10%，6%的丙稀酰胺，变性剂范围为30% 60%，电泳150V，6h，EB染色15min 后，凝胶成像系统，观察拍照。
全文摘要
本发明本发明涉及一种生物分析的方法，尤其涉及一种检测土壤微生物多样性的分析方法。该方法包括以下步骤(1)从土壤中进行DNA提取；(2)对步骤(1)中的DNA提取液中测出土壤中的DNA的浓度和纯度；(3)将土壤中提取的DNA进行PCR特异性扩增；(4)PCR反应产物的变性梯度凝胶电泳分析。利用本发明的方法对各种土壤进行的检测分析，其结果最接近真实的微生物状态。因为在处理的过程中，提取的DNA溶液无损失，对研究土壤中的微生物状态提供了完美的解决方法。
文档编号C12Q1/68GK102399855SQ201010277480
公开日2012年4月4日 申请日期2010年9月9日 优先权日2010年9月9日
发明者丁国才 申请人:上海海帝园艺有限公司