用于检测硫酸化寡糖的分析方法
【专利说明】用于检测硫酸化寡糖的分析方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 不适用
【背景技术】
[0003] 类肝素（肝素及硫酸乙酰肝素Ofeparansulfate))是多个重要生物过 程中已知的调节介质。类肝素及其衍生物低分子量肝素（low-molecularweight heparin，LMWH)已在外科手术及肾透析期间用作临床抗凝血药物。例如，磺达肝素钠 (CAS114870-03-0)是化学名称为0- [2-脱氧-6-0-磺酸基-2-(磺酰胺基）-a-D-吡 喃葡萄糖]-(1-4) -0- (β-D-吡喃葡萄糖醛酸）-(1-4) -0- [2-脱氧-3，6-二-0-磺酸 基-2-(磺酰胺基）-a-D-吡喃葡萄糖]-(1-4)-0-(2-0-磺酸基-a-L-吡喃艾杜糖醛 酸）-(1-4) -0- [2-脱氧-1-0-甲基-6-0-磺酸基-2-(磺酰胺基）-a-D-葡萄吡喃糖苷] 十钠盐的寡糖/肝素中的一员，由Choay，S.A.研发（参见美国专利第4,818,816号）。该 化合物是一合成的戊多糖因子Xa抑制剂，其用作预防经骨外科手术的患者的深层静脉栓 塞以及治疗深层静脉栓塞及肺栓塞的抗凝血药物。磺达肝素钠于2001年经美国食品药物 管理局批准，以商品名Arixtra?出售。磺达肝素钠为皮下用药。
[0004] 肝素及硫酸乙酰肝素分析方法在传统上涉及逆相层析及质谱（MS)技术，但因硫 酸乙酰肝素的高极性、结构多样性及硫酸盐不稳定性而存在限制。例如，使用MS对于合成 的多硫酸化寡糖进行定量受到限制，因为多硫酸化寡糖离子化时易于形成多种类型硫酸根 基团损失的片段及金属阳离子偶合加成物，这会导致更大的质谱复杂性及信号分裂。另外， 在分析期间难以显示硫酸根基团的损失程度，因为其取决于硫酸化寡糖的浓度及电荷态。 改良的多硫酸化寡糖分析方法是多组研究团队的目标。
[0005] Catalin等人（Anal.Chem. 2009,81，3485)及Tatiana等人（Anal.Chem. 2006， 78,1774)已分别阐述了通过使用电喷洒游离质谱（ESI-MS)及基质辅助激光解吸电离质谱 (MALDI-MS)来表征多硫酸化寡糖。然而，目前使用液相层析（LC)与质谱偶联的方法无法提 供在线过程内层析峰的解析/分离且因此在产生合成的多硫酸化寡糖期间无法建立结构 相关杂质的鉴定和/或多硫酸化寡糖的定量。
[0006] Imanari等人（J.Chromatogr.，A1996, 720, 275.)及Rice等人（J.Anal. Biochem. 1985,150, 325.)阐述了借助强阴离子交换层析（SAX)分析多硫酸化寡糖的方法。 此方法使用电荷密度差异来分离高度硫酸化寡糖，但因在流动相组合物中使用非挥发性盐 类，故仍难以直接将SAX与像MS的检测方法偶联。
[0007] 与多硫酸化寡糖分析方法相关的另一些问题是因多硫酸化寡糖的非发色特性 (极低UV吸收）所致，此会限制传统UV检测器的使用。其他通用检测器（例如折射率（RI) 检测器及蒸发光散射检测器（ELSD))亦对多硫酸化寡糖缺乏足够检测灵敏度。
[0008] 尽管已公开了一些多硫酸化寡糖检测方法，但仍存在多种限制。因此，仍需要改良 用于多硫酸化寡糖的分离、定量及质量（mass)鉴定的方法。本文所公开的稳定、灵敏且过 程中控制（in-processcontrol，IPC)方法解决了此需要及其他需要。 发明概要
[0009] 本文提供使用与电离子检测器（chargedaerosoldetector，CAD)或质谱仪（MS) 偶联的亲水性相互作用超高效液相层析仪（HILIC-UPLC)检测多硫酸化寡糖的方法。本文 所提供方法使得峰分辨率改良，因而允许样品中多硫酸化寡糖和/或杂质的后续定量。
[0010] HILIC的使用克服了滞留及分离极端极性寡糖的挑战。HILIC的滞留机制极为复 杂且为液液分配、吸附、离子相互作用及疏水性相互作用的多模式组合。因此，与逆相液相 层析（RPLC)相比，HILIC提供独特的选择性及滞留特性。
[0011] 如本文所述，在一组实施例中，用于HILIC管柱中的固定相是酰胺键合固定相。
[0012] 在另一实施例中，用于HILIC管柱中的流动相包含盐类。在一组实施例中，该盐类 为甲酸铵。与甲酸吡啶鑰盐及乙酸铵相比，甲酸铵的使用对滞留、选择性提供更佳的性能及 低噪声基线。
[0013] 在一些实施例中，盐类浓度高于50mM。在一些所选实施例，浓度高于100mM。通常， 流动相组合物中盐添加剂的摩尔强度会对层析滞留、选择性及灵敏度具有显著影响。随着 盐添加剂的摩尔浓度增加，液液分配相互作用压制了流动相与溶质的离子强度，其支配了 滞留机制而非离子交换作用。然而，现已发现在酸性分析物（例如多硫酸化寡糖）的情形 下，滞留随着盐添加剂的摩尔浓度增加而增强。具体而言，峰分辨率由于盐浓度自50mM增 加至约200mM而得以进一步改良。
[0014] 在一组实施例中，用于HILIC管柱中的流动相的溶剂为乙腈。
[0015] 在一些实施例中，用于定量多硫酸化寡糖的检测器是电离子检测器（CAD)。在使 用CAD进行分析期间，用电离气体（通常为氮气）使雾化粒子带电。在去除高流动性粒子 (主要为过量N2离子）后，对雾化粒子实施电测量。最重要的是，已证实该方法对非挥发性 分析物提供独立于其性质的均一响应。因此，⑴HILIC或HILIC-UPLC的分离技术与（2)诸 如MS或CAD的检测技术的组合使得多硫酸化的检测、鉴定和/或定量能够进行，因而提供 用于分析合成多硫酸化寡糖的有效方式。
[0016] 根据本发明的一个优选实施例，借助本文所述方法检测和/或定量的多硫酸化寡 糖为磺达肝素钠。
【附图说明】
[0017] 图 1 (a)提供使用Merck,SequantZic?-Hi丨ic(3. 5um2. 1X250mm)的横达肝素 钠的HILIC-CAD色谱图。
[0018] 图 1 (b)提供使用Merck,SequantZidpHilie(5um4. 6X150mm)的横达肝素钠 的HILIC-CAD色谱图。
[0019] 图 1 (c)提供使用Phenomenex,SynergiPolar-RP(4um4. 6X250mm)的横达肝素 钠之HILIC-CAD色谱图。
[0020] 图 1 (d)提供使用Phenomenex,SynergiFusion-RP(4um4. 6X150mm)的横达肝素 钠的HILIC-CAD色谱图。
[0021] 图 1 (e)提供使用SepaxPolar-Pyridine(1. 8um2. 1X150mm)的横达月干素钠的 HILIC-CAD色谱图。
[0022] 图 1 (f)提供使用ES，EpicDiol(1. 7um2· 1X150mm)的磺达肝素钠的HILIC-CAD 色谱图。
[0023] 图 1 (g)提供使用Waters,AcquityBH1HILIC(1. 7um2. 1X150mm)的磺达肝素钠 的HILIC-CAD色谱图。
[0024] 图 1 (h)提供使用Waters,AcquityΒΕ?Amide(1. 7um2. 1X1 50mm)的横达肝素钠 的HILIC-CAD色谱图。
[0025] 图2提供使用Waters,ΒΕ?Amide管柱（a)全图及（b)局部放大图的磺达肝素钠 的色谱图。
[0026] 图3提供了使用不同类型盐（a) 50mM甲酸铵（b)lOOmM甲酸铵（c)lOOmM甲酸吡啶 鑰盐及（d)50mM乙酸铵进行分析的药物成分的局部放大色谱图。
[0027] 图4提供了使用不同浓度甲酸铵（以局部放大图表示）（a) 50mM(b)lOOmM(c) 125m M(d)150mM(e)175mM及（f)200mM进行分析的药物成分局部放大色谱图（以局部放大图表 示）。
[0028] 图5提供了对流动相使用不同有机溶剂（a)流动相A: 200mM甲酸铵；流动相B:丙 酮及乙腈，1/1 (b)流动相A:200mM甲酸铵；流动相B:乙腈作为流动相进行分析的药物成分 色谱图（以局部放大图表示）。
【具体实施方式】
[0029] I.槪述
[0030] 本文提供针对多硫酸化寡糖研发的简明过程中分析方法，其涉及分别应用 HILIC-UPLC、CAD及MS进行分离、定量及质量鉴定。在制造期间的过程中控制（inprocess control,IPC)对于在高度硫酸化寡糖的全合成中确保质量控制至关重要。本文所述分析方 法可用作IPC方法。有利地，本文所述分析方法稳定、易于使用、灵敏，且在期望产率内确保 有质量的化学实体的制造。
[0031] II.本发明实施例
[0032] 鉴于上文，本文提供用于检测及定量样品中一或多种多硫酸化寡糖的方法，该方 法包含：
[0033] (a)在与电离子检测器（CAD)或质谱仪（MS)偶联的亲水性相互作用超高效液相层 析仪（HILIC-UPLC)管柱上对该样品实施层析，其中用于HILIC管柱中的固定相为酰胺键合 固定相；及
[0034] (b)测定该样品中多硫酸化寡糖的量。
[0035] 用于本方法中的样品通常是多硫酸化寡糖的合成制造方法的产物。因此，可根据 本方法借助选择反应混合物的试样来分析合成程序中最终步骤的样品。反应混合物的取样 允许杂质和/或多硫酸化寡糖的检测和/或定性和/或定量。反应混合物的取样亦允许反 应的完成程度的测定。可选地，可对最终产物实施本方法以确定是否需要进一步纯化。
[0036] 使用亲水性相互作用超高效液相层析仪的层析条件将通常涉及本领域技术人员 已知的那些条件，包括（但不限于）管柱选择（大小、长度及固定相）以及流动相和/或流 动相的pH。
[0037] 管柱的选择将通常涉及自市售管柱（例如那些购自Waters,ThermoFisher,Merck ，Phenomenex,Shodex,Nucleosil,和Sepax)的选