一种GelGreen染料在氯化铯密度梯度混合液中对DNA染色的方法【
技术领域：
】[0001]本发明涉及一种GelGreen染料在氯化铯密度梯度混合液中对DNA染色的方法，属于分子生物学
技术领域：
。【
背景技术：
】[0002]稳定性同位素探针技术(Stableisotopeprobing,SIP)是一种通过将稳定性同位素作为特定底物对环境微生物进行培养，使微生物在代谢底物的过程中将稳定性同位素结合到核酸(DNA和RNA)和磷脂脂肪酸(PLFA)等特异性生物标志物上，进而将微生物的特性与其特殊新陈代谢功能耦合起来的生物技术。与DNA-SIP相比，PLFA-SIP的不足在于大多数未培养微生物缺乏PLFA分子图式，难以将标记培养得到的PLFA与种属信息联系起来。对于RNA-SIP来说，由于环境样品中mRNA的量很低，很难从超高速密度梯度离心后回收足够下游分析的mRNA，因而限制了RNA-SIP在环境样品中的应用。由于DNA是稳定的遗传物质，携带大量的遗传多样性以及分子生态学信息，在短期SIP培养后能获得目标微生物的DNA,并且通过超高速密度梯度离心的方法将稳定性同位素标记的DNA(即重DNA)从未标记的DNA(即轻DNA)中分离出来，重DNA的遗传多样性能通过下游分析被鉴定，使得DNA-SIP成为耦合微生物遗传多样性与代谢功能最有力的工具之一。[0003]DNA-SIP技术主要包括4个步骤:用稳定性同位素标记的底物培养环境样品；提取培养环境样品总DNA以及超高速密度梯度离心；鉴定重层DNA;重层DNA的下游分析。鉴定重层DNA是DNA-SIP的难点和核心技术。目前用于鉴定重层DNA的方法主要有染色法、同位素比率质量光谱法、指纹分析法、分馏法等，其中染色法由于操作简单方便而被广泛应用。目前染色法所采用的DNA染料主要有两种，分别是溴化乙锭(StefanRadajewski,P.1.N.R.andJ.C.Murrell,Stable-1sotopeprobingasatoolinmicrobialecology.Nature,2000.255(5505):p.243-244)和SYBRsafe(Martineau,C.,L.G.WhyteandC.ff.Greer,DevelopmentofaSYBRsafe?techniqueforthesensitivedetect1nofDNAincesiumchloridedensitygradientsforstableisotopeprobingassays.JournalofMicrob1logicalMethods,2008.73(2):p.199-202)。利用溴化乙锭染色，需要大量的DNA(DNA的检出限为15μg)才能使其在紫外光的照射下可见，然而DNA在紫外光的照射下容易突变，影响下游分析。同时溴化乙锭是一种强的诱变剂，可致癌或致畸，这无论对操作人员、周围环境还是受试样品都存在着潜在的损害。与溴化乙锭相比，SYBRsafe染料具有更安全的性能，在激发波长为488nm的荧光透射仪的照射下能够使0.5μg的纯菌DNA形成明显的DNA亮带。但是对于环境样品而言，其丰富的物种多样性使得环境样品提取的基因组DNA也较纯菌复杂很多，在超高速密度梯度离心后会形成相对弥散的DNA目的层，从而降低SYBRsafe染料对DNA检测的灵敏度，因此限制了其在氯化铯超高速密度梯度离心技术中的应用。与溴化乙锭、SYBRsafe染料相比，GelGreen染料是集高灵敏、低毒性和超稳定于一身的极佳的焚光核酸染色试剂，能够检测到更少量的DNA。GelGreen染料的激发波长为488nm，能够在可见光激发的荧光透射仪激发下显色，对实验DNA没有损伤，不影响DNA下游分析，并且对操作人员和周围环境也没有毒害作用，属于环境友好型染料。因此，本发明采用GelGreen染料对环境样品DNA进行染色。[0004]鉴定重层DNA后，DNA的回收是重层DNA的下游分析的首要步骤。回收超高速密度梯度离心后的DNA的方法主要有两种，分别是分馏法和注射器直接抽取法。分馏法是利用匀速泵管将水或者清油从超高速离心管的顶端注入，从离心管底端收集超高速离心碎片的方法。分馏法一般与实时荧光定量PCR相结合，在看不到目的层DNA的情况下，将每一个超高速离心管里的密度梯度混合液分为16层。在纯化回收不同浮力密度层的DNA之后，通过实时荧光定量PCR来确定目的基因在每一浮力密度层中的数量。此方法操作繁琐耗时，并且无法保证在分馏过程中超高速离心管内不会发生混流现象。注射器直接抽取法是利用注射器在目的DNA所在位置进行穿刺，将目的DNA直接抽取出来的方法。注射器直接抽取法主要与染色法结合，通过染色法确定目的层DNA的位置，以发荧光的目的层DNA为基准，将每一个超高速离心管中的密度梯度混合液分成4?5层，利用注射器将相应的密度梯度混合液直接抽出。这样不仅能够准确地收集到目的层DNA，而且尽量避免在抽取目的层DNA的过程中对超高速离心管内的液体形成扰动。与分馏法相比，注射器直接抽取法大大减少了在超高速密度梯度离心后人为造成的分层，降低了目的层DNA下游分析的工作量。[0005]目前尚没有将GelGreen染料运用于氯化铯密度梯度混合液中对DNA进行染色的相关研宄。本发明将GelGreen染料染色法、注射器直接抽取法与实时荧光定量PCR相结合，将抽取出来的不同浮力密度层进行细菌16SrRNA基因qPCR定量，并与荧光透射仪照射的显色结果相结合，验证实验结果的准确性。此外，通过重复性实验来证明GelGreen染料在氯化铯密度梯度混合液中对DNA进行染色具有再现性。【
发明内容】[0006]本发明所要解决的技术问题在于提供一种高灵敏、低毒性的GelGreen染料在氯化铯密度梯度混合液中对DNA染色的方法。该染色方法大大提高了环境DNA在氯化铯密度梯度混合液中的检测灵敏度，使得在DNA-SIP超高速密度梯度离心后能够准确、便捷地回收目的DNA。[0007]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:[0008]—种GelGreen染料在氯化铯密度梯度混合液中对DNA染色的方法，包括以下步骤:[0009]步骤I，米集环境样品并提取环境总DNA;[0010]步骤2，配制环境总DNA-氯化铯混合液，并加入GelGreen染料；[0011]步骤3，将加入所述GelGreen染料的混合液进行超高速离心，得到密度梯度混合液；[0012]步骤4，将所述密度梯度混合液在激发波长为488nm的荧光透射仪的照射下进行分层，用注射器抽取相应层的密度梯度混合液；[0013]步骤5，对各层密度梯度混合液中的DNA进行细菌16SrRNA基因实时荧光定量PCR分析。[0014]进一步的，所述步骤I具体为:采集草坪土壤样品，用土壤DNA提取试剂盒提取环境总DNA。[0015]进一步的，所述环境总DNA为土壤微生物总DNA。[0016]进一步的，所述步骤2具体为:将环境总DNA与TE缓冲液或GB缓冲液配制为混合液，再加入氯化铯(CsCl)固体，涡旋混匀后再加入lg/mL的CsCl溶液和所述GelGreen染料；用AR200手持式折光仪测量配制好的环境总DNA-氯化铯混合液的浮力密度，并使用lg/mLCsCl溶液和TE缓冲液或GB缓冲液进行调节，使得环境总DNA-氯化铯混合液的浮力密度为1.72g/mL。[0017]进一步的，所述步骤3中超高速离心的速度、时间和温度分别为:45000转/分钟、44小时和200Cο[0018]进一步的，所述步骤4具体为:将密度梯度混合液在激发波长为488nm的荧光透射仪的照射下，以发荧光的目的层DNA为基准，将超高速离心管中的密度梯度混合液分成4部分，从上到下分别为1、I1、II1、IV层，利用所述注射器由上到下依次抽取出来；其中，目标条带在第II层；每层密度梯度混合液在测量浮力密度后，用PEG6000和70%乙醇洗涤并回收每层DNA。[0019]进一步的，所述步骤5具体为:选用细菌16SrRNA基因通用引物对1055F(5/-ATGGCTGTCGTCAGCT-3')和1392R(5'-ACGGGCGGTGTGTAC-3')，对各层密度梯度混合液中的DNA进行细菌16SrRNA基因拷贝数分析，以判断各层密度梯度当前第1页1 2 3