一种组织和细胞纯化用密度梯度溶液的配方的制作方法
【专利摘要】一种组织和细胞纯化用密度梯度溶液的配方，其配方中包括密度梯度成分，如碘海醇、泛影酸钠、碘克沙醇等，加入提高渗透压和防止组织和细胞水肿的物质，如棉子糖、海藻糖等，再加入钆喷酸葡胺，其溶剂为DMEM等培养液和HBSS等缓冲液。本发明解决了目前大动物及人的组织和细胞密度梯度分离困难，分离的组织和细胞活性低等问题，使那些消化或机械分散后不同密度的细胞和组织可通过本密度梯度液在离心条件下达到分离。我们设计了此种密度梯度溶液，对于促进国内外组织和细胞的分离研究，具有一定的应用价值。本发明原理简单，制备容易、使用方便，可达到规模化生产。本专利的申报为该密度梯度分离液的开发及应用于打下了基础。
【专利说明】
一种组织和细胞纯化用密度梯度溶液的配方
技术领域
[0001] 本发明涉及一种组织和细胞纯化过程中单独使用或与其他溶液共同配合使用的 密度梯度溶液配方，具体涉及一种基于细胞培养液基础上的组织和细胞纯化用的密度梯度 溶液，用于动物或人的组织和细胞的密度梯度纯化。
【背景技术】
[0002] 美国著名生物学家乔治·戴利说："二十世纪是药物治疗的时代，二十一世纪是细 胞治疗的时代"。人类移植学的发展是20世纪医学中最杰出的成就之一，尤其是上世纪70年 代末至80年代初，新的免疫抑制剂问世，使移植物的存活率和器官移植的临床疗效大为提 高。近年来由于临床移植病例大量增加，供体的短缺显得非常突出。进入21世纪，临床移植 术的研究和应用又被再次推向高潮，细胞移植，如骨髓移植、干细胞移植和胰岛细胞移植均 取得了显著的疗效。
[0003] 细胞移植是指将指将人体器官、组织来源的具有正常生理功能的适量游离的活细 胞移植到受体(人或动物)的血管、体腔或组织器官内，以达到治疗目的的技术。细胞移植的 临床应用日益广泛，其中骨髓与造血干细胞移植备受瞩目，可用于治疗遗传性联合免疫缺 陷病、重症地中海贫血等遗传性疾病、重症再生障碍性贫血，以及包括各种白血病在内的血 液系统恶性肿瘤等疾病。此外，还有胰岛细胞移植治疗1型糖尿病，肝细胞移植治疗重症肝 炎肝昏迷，脾细胞移植治疗重症血友病甲，以及睾丸Leydig细胞移植治疗男性性功能低下 (低睾酬血症)等。
[0004] 细胞移植(如胰岛细胞移植、骨髓移植、干细胞移植、肝细胞移植等)在糖尿病、癌 症、肝病、遗传病及组织损伤等疾病的治疗上显示出越来越高的应用价值，在部分治疗领 域，如糖尿病、白血病等方面已大大超越了大器官移植和放化疗的治疗手段，已成为目前外 科器官移植发展的重要方向。
[0005] 细胞移植是外科学移植的新方向，是国家863重点资助方向之一，属于新兴生物医 药产业，对细胞的研究与应用是心血管疾病、糖尿病、神经系统疾病、肝脏疾病等治疗的新 途径和新希望，是医学领域国际竞争的热点。该新兴生物医药产业具有高科技、高附加值、 成本低、污染少的优势，是政府重点扶持方向。
[0006] 胰岛移植为根治临床1型糖尿病和2型糖尿病终末期患者的好方法，胰岛细胞移植 因其对胰腺供体要求低、移植操作简单，几乎不需要手术、副作用小，而全胰腺移植对供体 要求高、外分泌腺处理复杂，术后并发症多;近几年来随着新型免疫抑制方案的应用，胰岛 细胞的基础研究，胰岛分离、纯化的数量与质量也得到了很大的提升，胰岛移植在糖尿病的 临床治疗中获得了重大进展;据2012年报道，胰岛移植后5年胰岛素不依赖率已经达到了 50%，与全胰腺移植(52%)已没有差异。医学界一直将胰岛细胞移植推崇为治疗糖尿病最 理想的方法，胰岛移植的临床应用已成为不可阻挡的趋势，正如世界胰腺移植的鼻祖 Sutherland医生在世界移植大会上所预言的，胰岛移植正取代胰腺移植在世界上逐步推广 应用，成为糖尿病患者的福音。在未来几十年里，胰岛移植将可能成为治疗血糖不稳定1型 糖尿病和2型糖尿病终末期患者的最佳选择。
[0007] 胰岛细胞移植治疗血糖不稳型1型糖尿病和2型糖尿病终末期患者的研究已在全 世界走过了40多年，尤其在2000年加拿大Sharpiro教授领导的团队公布了 "Edmonton方案" 以后。事实证明，胰岛移植不仅能控制病人的血糖，更重要的是能够抑制和改善病人并发症 的发生。但是Edmonton胰岛移植治疗计划还不够完善，病人能长期完全脱离胰岛素依赖的 结果还不是很理想。胰岛移植的临床应用在近几年进展很快，早在2004年，由美国NIH投入 1.7亿美元开展临床胰岛分离及移植程序的标准化和7个新的免疫治疗方案的评估项目，其 中项目名为CIT07的免疫治疗方案进行了临床48例患者的治疗，术后患者全部脱离胰岛素 治疗，部分病人完全不用胰岛素治疗已超过4年，胰岛生存时间已达到全胰腺移植水平。加 拿大、欧洲和澳大利亚等国家已批准胰岛移植进入医疗保险，自体胰岛移植在美国也早已 进入医疗保险。目前随着人口老龄化的加剧，国内糖尿病、胰腺疾病等的发病率逐年上升， 细胞移植技术也必将在国内将逐渐蓬勃发展起来。
[0008] 胰岛分离纯化的目的是从胰腺消化后的组织中提取完整的胰岛，该步骤的主要原 理是胰岛细胞比外分泌/导管组织有一个更低的密度。如果这些类型细胞在胰腺消化过程 中已被有效分离，则我们可以通过很多手段将胰岛细胞纯化出来。在人胰岛的大规模纯化 中最重要的进展是使用C0BE 2991细胞分离机用于胰岛的纯化。该离心机最初是专门用于 分离血液中不同的细胞成分，但基于胰腺消化后不同组织的密度差，该机器也适用于分离 人膜岛。
[0009] 密度梯度离心(density gradient centrifugation)亦称平衡密度梯度离心法。 用离心机对小分子物质溶液，长时间加一个离心力场达到沉降平衡，在沉降池内从液面到 底部出现一定的密度梯度。若在该溶液里加入少量大分子或组织、细胞溶液，则溶液内比溶 剂密度大的部分就产生沉降，比溶剂密度小的部分就会上浮，最后在离心力和浮力平衡的 位置，集聚形成沉降物的带状物。利用这种现象，可测定核酸或蛋白质等的浮游密度，或根 据其差别进行分离细胞或组织的一种沉降平衡法。自1958年米西尔逊(M.Meselson)，斯塔 尔(F. W. Stahl)，维诺格拉德(J. Vinograd)成功地分离了〔 15N〕DNA和〔14N〕DNA以来，该法取 得许多成果。该方法多采用浓氯化铯溶液，所以有时也使用氯化铯浓度梯度离心法这个名 称，还可采用氯化铷、溴化铯等溶液。
[0010] 但在细胞或组织等以纯化为目的的分离，也常使用离心机利用预先制备好的蔗糖 等密度梯度液的密度差进行分离。其工作原理为:不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定 离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。密度梯 度介质应预先形成，介质的最大密度要小于所有样品颗粒的密度。
[0011] 密度梯度如果是不连续的，组织在密度相近的密度界面重叠;密度梯度也可以是 连续的密度梯度，这样细胞可以根据梯度液的精确密度进行有效的分离。
[0012] 对于密度梯度溶液的配制，国外有一些相关的文献介绍，其中一些已用于胰岛纯 化，包括鹿糖、聚鹿糖(Ficoll)、透析聚鹿糖(dialysed Ficoll)、聚鹿糖泛影葡胺(Ficoll Hypaque)、甲泛葡胺(Metrizamide)、胶体娃(Percoll)、聚鹿糖康瑞(Ficoll Conray)、葡聚 糖（Dextran)、牛血清白蛋白溶液、聚鹿糖泛影酸钠 （Ficoll Diatrizoic)、碘克沙醇 (〇虹1&]1〇1)和碘海醇07〇〇(161^)，等。另外还有对5〇个等密度分离用密度梯度介质的介绍 说不会改变胰岛密度和外分泌组织密度重叠的事实。常用于人胰岛分离纯化的两个密度梯 度介质为Euro-Ficoll和高渗透压牛血清白蛋白（500m0sm/kg/H20) jicoll和牛血清白蛋 白对于细胞分离的利弊已在一些文献上有过论述。Ficoll的优势在于其溶液澄清透明，可 高压灭菌和非动物来源。它的缺点是加剧细胞的聚集和高浓度时通过结合水来显著增加渗 透性能。牛血清白蛋白的优点是对细胞有一定的保护作用和降低细胞聚集，缺点是来源于 动物和易被污染。胰岛分离纯化的发展也已经显示溶解密度梯度成分的溶液组成比密度梯 度成分更重要，这个事实在其他细胞的分离中也已发现了多年。
[0013] 胰岛分离的密度梯度液也在不断的改进。如通过在UW液中增加额外的羟乙基淀粉 溶液或胶体硅(Percoll)来配制密度梯度液；由Ficoll密度梯度液(1.100g/ml)和UW液两种 溶液组成新的密度梯度液，虽然这种修改减少了密度梯度的范围，但它允许加载更多的消 化组织(原来的两倍多），并可在一轮纯化中进行有效分离。这加快了全部的胰腺处理时间 (原来的连续密度梯度技术往往需要2轮纯化）。然而，这种调整可能并不适合所有的胰岛分 离中心，因为UW液的最佳使用温度在4°C，所以为了保证胰岛活性，C0BE 2991必须改装并在 这个温度下运行，被安置在一个冷的房间。
[0014] 为了增加待分离的组织或细胞间的密度差，防止组织或细胞的水肿是一个重要的 措施。这方面可采用加入一些大分子非渗透的渗透压促进剂来实现，如棉子糖、海藻糖、乳 糖酸钾、羟乙基淀粉等。
[0015] 为了更好的保持待分离物质在密度梯度分离液中的活性，本发明采用细胞培养液 DMEM、RPMI 1640、CMRL 1066、M199或缓冲液HBSS、Hanks液作为该密度梯度分离液的溶剂， 经实验证明，分离得到的组织和细胞活性良好。
[0016] IL喷酸葡胺（Gadopentetate dimeglumine)又称为IL喷酸葡甲胺、二乙稀三胺五 醋酸钆双葡甲胺、钆喷葡胺或马根维显，是一种常用的核磁共振的造影剂。本品静脉给药后 很快弥散到体内各组织的细胞外液内，然后经肾小球滤过以原形排出，有少量分泌于胃肠 道后随粪便排出，不良反应少。其分子量为938，临床用浓度为:37%-47%。经实验证明，将 钆喷酸葡胺加入至上述由聚蔗糖400、碘克沙醇、碘海醇等密度梯度成分与棉子糖、海藻糖、 乳糖酸钾、羟乙基淀粉等成分，以细胞培养液DMEM、RPMI 1640、CMRL 1066、M199或缓冲液 HBSS、Hanks溶液为溶剂配成的密度梯度液中，可显著增加待分离成分的分离效果。
[0017]本发明专利以碘克沙醇、碘海醇、泛影酸钠、甲泛葡胺、胶体硅、聚蔗糖400-种或 几种成分的混合作为主要密度梯度物质，以棉子糖、海藻糖、乳糖酸钾、羟乙基淀粉一种或 几种成分的混合作为防止组织和细胞水肿的物质，再加入钆喷酸葡胺，以DMEM、RPMI 1640、 CMRL 1066、M199培养液中的一种或其改进后的溶液中的一种为溶剂，配制得到的一种组织 和细胞密度梯度分离溶液。
[0018]除去聚蔗糖400,密度梯度溶液的配方中的密度梯度成分为碘克沙醇、碘海醇、泛 影酸钠、胶体硅、甲泛葡胺、胶体硅一种或几种成分的混合作为主要密度梯度物质，以棉子 糖、海藻糖、乳糖酸钾、羟乙基淀粉一种或几种成分的混合作为防止组织和细胞水肿的物 质，再加入钆喷酸葡胺，还可以HBSS、Hanks液中的一种或其改进后的溶液中的一种为溶剂， 配制得到的一种组织和细胞密度梯度分离溶液。
[0019] 密度梯度液的质量可通过对其溶液质量、组织和细胞分离效率进行评价。
[0020] 犬或猕猴等大动物或人的组织和细胞移植往往先需要进行组织和细胞的分离，密 度梯度离心又是这些分离方法中较常用的方法，如胰岛组织的分离。如果能得到大量高纯 度、活性好的胰岛细胞，将对其体内移植和提高糖尿病治疗效果有重要作用。本专利的申报 为该密度梯度分离液的开发及应用于打下了基础。
【发明内容】
[0021] 针对目前大动物或人体组织和细胞移植的趋势不断发展，对组织分离的纯度、量 和活性或功能的要求也越来越高，才能保证更好的移植效果，因此我们设计了此种新型组 织和细胞分离纯化试剂，可提高组织和细胞的分离效率，弥补常规分离试剂在分离细胞的 效率和活性方面的不足，对于促进国内细胞和组织的分离和移植研究，具有较好的应用价 值。本组织和细胞分离溶液也为进行该产品的临床细胞和组织移植应用奠定基础。
[0022] 本发明专利的目的在于提供一种原理简单，制备容易，使用方便，组织和细胞分离 效率高，活性好的密度梯度纯化试剂，使用此密度梯度液，结合密度梯度离心，可使相关的 密度不同的组织和细胞进行分离。
[0023] 本发明是采用下述方案实现的，一种组织和细胞纯化用密度梯度溶液的配方中的 密度梯度成分为碘克沙醇、碘海醇、泛影酸钠、甲泛葡胺、胶体硅、聚蔗糖400中的一种或几 种组合组成，以棉子糖、海藻糖、乳糖酸钾、羟乙基淀粉一种或几种组合作为提高渗透压和 防止组织和细胞水肿的物质，其溶剂成分为DMEM、RPMI 1640、CMRL 1066、M199培养液中的 一种或其改进后的溶液中的一种。
[0024] -种组织和细胞纯化用密度梯度溶液的配方中的密度梯度成分为碘克沙醇、碘海 醇、泛影酸钠、甲泛葡胺、胶体硅中的一种或几种组合组成，以棉子糖、海藻糖、乳糖酸钾、羟 乙基淀粉中的一种或几种组合作为提高渗透压和防止组织和细胞水肿的物质，其溶剂成分 为HBSS、Hanks液中的一种或其改进后的溶液中的一种。
[0025] -种组织和细胞纯化用密度梯度溶液的配方中还含有钆喷酸葡胺。
[0026] 所述的一种组织和细胞纯化用密度梯度溶液的配方中密度梯度各成分通常在密 度梯度液中使用的浓度为碘克沙醇5%_70%，碘海醇3%-75%，泛影酸钠3%-75%，甲泛葡 胺3%-75%，胶体硅3%-75%，聚蔗糖4003%-75%。
[0027] 所述的一种组织和细胞纯化用密度梯度溶液的配方中的提高渗透压和防止组织 和细胞水肿的成分通常在密度梯度液中使用的浓度为棉子糖〇 . 5 % -50 %、海藻糖0.5 % -55%、乳糖酸钾0.5%-35%、羟乙基淀粉0.1 %-30%。
[0028] -种组织和细胞纯化用密度梯度溶液的配方中钆喷酸葡胺浓度可为0.1%-65%。 [0029] 所述的一种组织和细胞纯化用密度梯度溶液的配方中的溶剂成分可以为DMEM、 RPMI1640、CMRL 1066、M199培养液中的一种或其改进后溶液中的一种，如溶剂分别为0.5-5 倍浓度的DMEM溶液，0.5-5倍浓度的RPMI 1640溶液，0.5-5倍浓度的CMRL 1066溶液，0.5-5 倍浓度的Ml 99溶液。
[0030] 所述的一种组织和细胞纯化用密度梯度溶液的配方中的溶剂成分可以为HBSS、 Hanks液中的一种或其改进后溶液中的一种，如溶剂分别为0.5-5倍浓度的HBSS，0.5-5倍浓 度的Hanks液。
[0031] 所述的一种组织和细胞纯化用密度梯度溶液其制备方法一般为将密度梯度成分、 提高渗透压和防止组织、细胞水肿的成分和钆喷酸葡胺，溶解于相应的溶剂中，过滤除菌即 得。
[0032] 本发明由于采用上述方案，将碘克沙醇、碘海醇、泛影酸钠、甲泛葡胺、胶体硅、聚 蔗糖400中的一种或几种组合，提高渗透压和防止细胞水肿成分棉子糖、海藻糖、乳糖酸 钾、羟乙基淀粉中的一种或几种组合，再加入钆喷酸葡胺，结合DMEM、RPMI 1640、CMRL1066、 M199培养液中的一种或其改进后溶液中的一种，制备成一种组织和细胞分离用的密度梯度 液。
[0033] 本发明由于采用上述方案，将碘克沙醇、碘海醇、泛影酸钠、甲泛葡胺、胶体硅中的 一种或几种组合，提高渗透压和防止细胞水肿成分棉子糖、海藻糖、乳糖酸钾、羟乙基淀粉 中的一种或几种组合，再加入钆喷酸葡胺，结合HBSS、Hanks液中的一种或其改进后溶液中 的一种，制备成一种组织和细胞分离用的密度梯度液。
[0034]本发明原理简单，制备容易，使用方便，组织和细胞分离结果理想，可达到规模化 批量生产，起到促进组织和细胞分离，促进临床和科研领域的细胞移植研究应用。
【附图说明】
[0035] 附图1为实施例2高密度液和实施例3低密度液进行密度梯度混合的过程中，用 15ml离心管每1分钟收集的密度梯度混合液，测得的混合液密度梯度变化曲线。
【具体实施方式】
[0036] 本发明的一种组织和细胞纯化用密度梯度溶液，由于采用上述方案，将碘克沙醇、 碘海醇、泛影酸钠、甲泛葡胺、胶体硅、聚蔗糖400,提高渗透压和防止细胞水肿成分棉子糖、 海藻糖、乳糖酸钾、羟乙基淀粉，再加入钆喷酸葡胺，结合DMEM、RPMI 1640、CMRL 1066、 HBSS、Hanks、M199培养液或、HBSS、Hanks液其中一种或改进后溶液的一种，其制备方法一般 为将密度梯度成分、提高渗透压和防止细胞水肿成分和钆喷酸葡胺，溶解于相应的溶剂中， 过滤除菌即得一种组织和细胞分离用的密度梯度液。
[0037] 实施例1
[0038]本发明实施例1的一种组织和细胞纯化过程中使用的密度梯度液配方如下：
[0039] (1)配方一:碘克沙醇248.0g，乳糖酸钾15g，钆喷酸葡胺5g，RPMI1640定容至1L。
[0040] (2)制备工艺：
[0041 ] 1)取RPMI 1640各成分(RPMI 1640的成分可参考下表1)，先用80%的三蒸水进行 溶解，必要时先用HC1调酸进行溶解，再用NaOH进行调pH值中和，再用三蒸水定容至1L。
[0042] 表1RPMI 1640各成分表
[0043]
[0044]
[0045] 2)准确称取碘克沙醇248. Og，乳糖酸钾15g，钆喷酸葡胺5g，至1L灭菌后玻璃瓶中， 用800ml上述RPMI 1640溶液溶解，再用上述RPMI 1640溶液定容至1L。必要时用IN HC1或 NaOH调pH至7.2±0.2，用手持式电子密度计测定密度为1.132±0.001g/ml，如果没有，则可 少量加入碘克沙醇或RPMI 1640进行密度调整。
[0046] 3)在B级背景下局部A级洁净区先用0 · 45μηι后用0 · 22μηι微孔滤膜过滤，500mL/瓶。
[0047] (3)配方二:碘克沙醇248.0g，乳糖酸钾15g，RPMI1640定容至1L。
[0048] (4)制备工艺：制备工艺同配方一。用手持式电子密度计测定密度为1.132土 0.001 g/ml，如果没有，则可少量加入碘克沙醇或RPMI 1640进行密度调整。
[0049] (5)密度梯度液的质量评价
[0050] 1)用渗透压测定仪测定溶液的渗透压是否为310-360m0sm/kg;内毒素测定确定内 毒素含量是否<〇.25EU/mL。
[0051 ] 2)盖紧瓶盖，并用塑料封盖膜热封;细菌培养结果为无菌。
[0052] (6)胰岛组织分离的方法
[0053] 1)采用连续密度梯度离心方法，将消化和洗涤后的胰岛组织20ml，混悬于4°C的 RPMI1640溶液中并定容至100ml。
[0054] 2)高密度液:采用上述配制的密度为1.132±0.001g/ml的密度梯度溶液约470ml， 用市售的器官保存液UW液在4°C左右稀释，得到密度为1.10±0.001g/ml的高密度液约 500ml〇
[0055] 3)低密度液:采用市售Optiprep溶液约30ml，用UW液在4°C左右稀释成密度为1.06 ±0.01g/ml的低密度液，总共约250ml。
[0056] 4)采用蠕动栗将120-130ml的高密度液先导入至⑶BE 2991细胞分离机中的细胞 纯化袋中，开启细胞分离机，2000rpm，除去细胞纯化袋中的气泡。
[0057] 5)采用密度梯度混合器，将上述高密度液和低密度液分别放置于两个桶中，再打 开两个桶中间的连接器，将低密度液通过连接器缓慢流至高密度液中并混合，再通过蠕动 栗导入至高速离心的细胞纯化袋中。
[0058] 6)等全部的密度梯度液导入至细胞分离袋中后，再逐渐将含胰岛组织的液体缓慢 导入至细胞分离袋中，使胰岛组织与外分泌组织分布在不同的密度梯度液层中，达到分离 的目的。
[0059] 7)将分离的胰岛逐步收集到含CMRL 1066的不同的收集管中。进行纯化后的质量 检验。
[0060] (5)胰岛纯化的结果
[0061] 1)胰岛回收率:收集纯化得到的>30%纯度的人胰岛组织，胰岛回收率=纯化后 的胰岛当量/纯化前的胰岛当量*100%;配方一得到的胰岛回收率达70.6%，而配方二不含 钆喷酸葡胺的密度梯度液胰岛回收率为51.4%，说明加钆喷酸葡胺后的密度梯度液胰岛回 收率明显增加。
[0062] 2)胰岛的活性:采用纯化后的胰岛组织进行ro-PI染色，在荧光显微镜下检查胰岛 的活性，发绿色荧光的为活细胞，发红色荧光的为死细胞，以活细胞占整个细胞团的体积比 率来定义胰岛细胞团的活性，结果配方一得到的胰岛平均活性为88.7%，配方二得到的胰 岛平均活性为86.8%，说明两个配方的密度梯度液得到的胰岛活性接近。
[0063] 实施例2
[0064] 本发明实施例2的一种组织和细胞纯化过程中的高密度的密度梯度液配方如下：
[0065] (1)配方:碘克沙醇204 · 0g，泛影酸钠 7 · 36g，钆喷酸葡胺10 · 0g，CMRL 1066定容至 lL〇
[0066] (2)制备工艺：
[0067] 1)取CMRL 1066各成分(CMRL 1066的成分可参考下表2)，先用80%的三蒸水进行 溶解，必要时先用HC1调酸进行溶解，再用NaOH进行调pH值中和，再用三蒸水定容至1L。
[0068] 表2CMRL 1066各成分表
[0069]
[0070]
[0071] 2)准确称取碘克沙醇204. Og，泛影酸钠7.36g，钆喷酸葡胺10.0 g，至1L灭菌后玻璃 瓶中，用800ml上述CMRL 1066溶液溶解，再用上述CMRL 1066溶液定容至1L。必要时用1N HC1或NaOH调pH至7.2±0.2,用手持式电子密度计测定密度为1.10±0.01g/ml，如果没有， 则可少量加入碘克沙醇、泛影酸钠或CMRL 1066进行密度调整。
[0072 ] 3)在B级背景下局部A级洁净区先用0 · 45μηι后用0 · 22μηι微孔滤膜过滤，500mL/瓶。
[0073] (3)密度梯度液的质量评价
[0074] 1)用渗透压测定仪测定溶液的渗透压是否为410-460m0sm/kg;内毒素测定确定内 毒素含量是否<〇.25EU/mL。
[0075] 2)盖紧瓶盖，并用塑料封盖膜热封;细菌培养结果为无菌。
[0076] 实施例3
[0077] 本发明实施例3的一种组织和细胞纯化过程中的低密度的密度梯度液配方如下：
[0078] (1)配方：碘克沙醇10 · 22g，泛影酸钠3 · 59g，钆喷酸葡胺15g，CMRL 1066定容至 250ml〇
[0079] (2)制备工艺：
[0080] 1)准确称取碘克沙醇l〇.22g，泛影酸钠3.59g，钆喷酸葡胺15g至1L灭菌后玻璃瓶 中，用200ml上述CMRL 1066溶液溶解，再用上述CMRL 1066溶液定容至250ml。必要时用1N HC1或NaOH调pH至7.2 ± 0.2，用手持式电子密度计测定密度为1.06 ± 0.01 g/ml，如果没有， 则可少量加入碘克沙醇、泛影酸钠或CMRL 1066进行密度调整。
[0081 ] 3)在B级背景下局部A级洁净区先用0 · 45μηι后用0 · 22μηι微孔滤膜过滤，500mL/瓶。
[0082] (3)密度梯度液的质量评价
[0083] 1)用渗透压测定仪测定溶液的渗透压是否为450-530m0sm/kg;内毒素测定确定内 毒素含量是否<〇.25EU/mL。
[0084] 2)盖紧瓶盖，并用塑料封盖膜热封;细菌培养结果为无菌。
[0085] (4)胰岛组织分离的方法
[0086] 1)采用连续密度梯度离心方法，将消化和洗涤后的胰岛组织20ml，混悬于4°C的 RPMI1640溶液中并定容至100ml。
[0087] 2)高密度液：用蠕动栗将采用上述实施例2配制的密度为1.10±0.01g/ml的密度 梯度溶液约125ml先导入至C0BE 2991细胞分离机中的细胞纯化袋中，开启细胞分离机， 2000rpm，除去细胞纯化袋中的气泡。
[0088] 5)采用密度梯度混合器，将上述实施例2高密度液和实施例3低密度液分别放置于 密度梯度混合器的两个桶中，再打开两个桶中间的连接器，将低密度液通过连接器缓慢流 至高密度液中并混合，再通过蠕动栗导入至高速离心的细胞纯化袋中。
[0089] 6)等全部的密度梯度液导入至细胞分离袋中后，再逐渐将含胰岛组织的液体缓慢 导入至细胞分离袋中，使胰岛组织与外分泌组织分布在不同的密度梯度液层中，达到分离 的目的。
[0090] 7)将分离的胰岛逐步收集到含CMRL 1066的不同的收集管中，进行纯化后的质量 检验。
[0091] (5)结果
[0092] 1)密度梯度结果:将上述实施例2高密度液和实施例3低密度液进行密度梯度混合 的过程中，用15ml离心管每1分钟收集一管密度梯度混合液，测定其密度，得到的密度梯度 变化曲线如图1所示，由图1可知，高密度液和低密度液混合过程中，密度是从高到低逐渐下 降，混合液的起始密度接近于高密度液，终末密度接近于低密度液，这样有利于组织在各个 密度层的找到各自适合的密度层，进而有利于组织的分离。
[0093] 2)胰岛组织回收率和活性:可收集得到不同纯度的人胰岛组织，胰岛的回收率可 达72.5%;活性达89.3%。
【主权项】
1. 一种组织和细胞纯化用密度梯度溶液的配方，其特征在于:配方中的密度梯度成分 为碘克沙醇、碘海醇、泛影酸钠、甲泛葡胺、胶体硅、聚蔗糖400中的一种或几种成分组合组 成，以棉子糖、海藻糖、乳糖酸钾、羟乙基淀粉中的一种或几种成分组合作为提高渗透压和 防止组织和细胞水肿的物质，其溶剂成分为DMEM、RPMI 1640、CMRL 1066、M199培养液中的 一种或其改进后的溶液中的一种。2. -种组织和细胞纯化用密度梯度溶液的配方，其特征在于:配方中的密度梯度成分 为碘克沙醇、碘海醇、泛影酸钠、甲泛葡胺、胶体硅中的一种或几种成分组合组成，以棉子 糖、海藻糖、乳糖酸钾、羟乙基淀粉中的一种或几种成分组合作为提高渗透压和防止组织和 细胞水肿的物质，其溶剂成分为HBSS、Hanks液中的一种或其改进后的溶液中的一种。3. 根据权利要求1和2所述的一种组织和细胞纯化用密度梯度溶液的配方，其特征在 于:配方中还含有IL喷酸葡胺0.1 %-65%。4. 根据权利要求1所述的一种组织和细胞纯化用密度梯度溶液的配方，其特征在于:配 方中密度梯度各成分使用的浓度为碘克沙醇5 % -70 %，碘海醇3 % -75 %，泛影酸钠3 % -75 %，甲泛葡胺3%-75%，胶体硅3 %-75 %，聚蔗糖4003%-75% ;其配方中的提高渗透压和 防止组织和细胞水肿的成分通常在密度梯度液中使用的浓度为棉子糖0.5 % -50 %、海藻糖 0· 5%-55%、乳糖酸钾0· 5%-35%、羟乙基淀粉0· 1 %-30%。5. 根据权利要求2所述的一种组织和细胞纯化用密度梯度溶液的配方，其特征在于:配 方中密度梯度各成分使用的浓度为碘克沙醇5 % -70 %，碘海醇3 % -75 %，泛影酸钠3 % -75%，甲泛葡胺3%-75%，胶体硅3%-75% ;其配方中的提高渗透压和防止组织和细胞水肿 的成分通常在密度梯度液中使用的浓度为棉子糖0.5%-50 %、海藻糖0.5%-55%、乳糖酸 钾0· 5%-35%、羟乙基淀粉0· 1 %-30%。6. 根据权利要求1所述的一种组织和细胞纯化用密度梯度溶液的配方，其特征在于:所 述的一种组织和细胞纯化用密度梯度溶液的配方中的溶剂成分可以为DMEM、RPMI 1640、 CMRL 1066、M199培养液中的一种或其改进后的溶液中的一种，如溶剂分别为0.5-5倍浓度 的DMEM溶液，0.5-5倍浓度的RPMI1640溶液，0.5-5倍浓度的CMRL 1066溶液，0.5-5倍浓度的 Ml 99溶液。7. 根据权利要求2所述的一种组织和细胞纯化用密度梯度溶液的配方，其特征在于:所 述的一种组织和细胞纯化用密度梯度溶液的配方中的溶剂成分可以为HBSS、Hanks液中的 一种或其改进后的溶液中的一种，如溶剂分别为〇. 5-5倍浓度的HBSS，0.5-5倍浓度的Hanks 液。8. 根据权利要求1所述的一种组织和细胞纯化用密度梯度溶液的配方，其特征在于:所 述的一种组织和细胞纯化用密度梯度溶液其制备方法为将密度梯度成分、提高渗透压和防 止组织和细胞水肿的成分、钆喷酸葡胺溶解于相应的溶剂中，过滤除菌即得。9. 根据权利要求2所述的一种组织和细胞纯化用密度梯度溶液的配方，其特征在于:所 述的一种组织和细胞纯化用密度梯度溶液其制备方法为将密度梯度成分、提高渗透压和防 止组织和细胞水肿的成分、钆喷酸葡胺溶解于相应的溶剂中，过滤除菌即得。
【文档编号】C12N5/071GK105886454SQ201610205894
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年3月28日
【发明人】傅红兴, 刘成洋, 蒋煊, 赵应征
【申请人】温州市怡康细胞移植技术开发有限公司