专利名称：一种基于溶剂萃取耦合ftir快速分析磷脂的方法
技术领域：
本发明涉及一种磷脂的測量方法，特别涉及一种基于溶剂萃取耦合FIlR快速分析磷脂的方法。
(ニ)
背景技术：
磷脂，作为膳食成分之一，对人体有许多生理功能，如调节脂肪代谢，转运必需脂肪酸，预防动脉硬化、高血压、血栓、及溃疡等疾病。磷脂主要来源于植物油脂，如大豆毛油中磷脂含量约为0. 5-2%。但从加工エ艺上来讲，植物油中磷脂的存在是不利的，会増加脱酸环节中性油的损失及脱色白土的用量，而且还容易引起加氢催化剂的中毒。精炼油中磷脂过高容易氧化影响产品色泽，此外其烟点低，烹调时易分解发烟。色拉油中磷脂含量应低于 200ppm，一般在 12. 5_150ppm 之间。磷脂分析的方法较多。AOAC官方方法999. 14对于膳食中磷脂的测定是基于样品碱法消化后，酶水解释放胆碱，然后比色測定胆碱的原理。该法的缺点是并非所有磷脂単体都含胆碱基团。总磷脂的测定是首先采用湿法酸消化，然后对磷元素采用Barlett arseno-molybdate法。问题是非磷脂磷会带来较大的误差。此外上述方法均准确度不高， 而且操作繁琐、费吋。采用色谱法(如HPLC)可对磷脂单体进行准确定量，但成本昂贵，检测限亦不高，而且复杂的样品富集前处理同样不可或缺。Nzai等尝试了 FT顶技术分析大豆油中的磷脂含量，发现相对于传统的湿法磷分析技术及TLC耦合密度扫描技术具有快速、简单、稳定的优点，但其背景如何扣除不清楚， 方法的准确性和精确性均不高。Szydtowska-Czerniak在^feai研究基础上引入偏最小平方和回归(partial least squares regression)模型定量对菜油中磷脂定量，准确度有所改善，但依然存在诸多问题如干扰物甘油三酯的浓度过高超出比尔定律范围、分离度不高， 分析准确度低。为克服上述问题，Kuligowski等采用在线凝胶过滤色谱分离/ATR-FIlR色谱检测技术同时检测膳食成分中磷脂和大豆油含量，并采用一阶导数图谱增加峰拆分，取得了较好的效果。但由于衰减全反射色谱分辨率不高，该方法对磷脂的检测限仅为ang/ mL(2000ppm)。此外，也有许多研究人员探讨采用FT-OTR技术分析人脑磷脂质组成、监测大豆油精炼过程中副产物和磷脂等。然而，要建立精确的定量模型，往往需要较大的样本容量，成本较高，而且也不适用于低磷脂含量的样品(< IOOOppm)。
发明内容
本发明目的是提供一种基于溶剂萃取耦合FIlR快速分析磷脂的方法，该方法适合较低浓度磷脂含量O00ppm-5000ppm)样品的快速、自动化分析方法。由于磷脂红外分析时最大误差来源于结构类似物甘油三酯的干扰，本发明采用溶剂萃取样品中的磷脂，其大部分中性甘油三酯等干扰物留在萃余相中，然后采用FIlR透射光谱分析萃取样品中磷脂含量。CN 102539371 A本发明采用的技术方案是一种基于溶剂萃取耦合FIlR快速分析磷脂的方法，所述方法为(1)将含200 5000ppm磷脂的油脂A用有机溶剂A萃取后，取上层萃取液A，在波谱范围4000 ^OcnT1 检测红外波谱，记为S_5 ；所述有机溶剂A为乙腈、DMS0、甲醇、乙醇中的ー种或ー种以上的混合；(2)另外取与油脂A相同的油脂B，油脂B经硅胶柱处理后获得脱胶油B，将脱胶油B 用有机溶剂B萃取，取上层萃取液B，在波谱范围4000 400CHT1检测红外波谱，记为S_4 ； 所述有机溶剂B与有机溶剂A相同；( 对S_4和S_5进行差谱分析，得到差谱S_6的ニ阶导数图谱S_7，读取ニ阶导数图谱S_7在4000 400CHT1范围各特征峰的吸收强度，根据磷脂标准曲线获得油脂A中磷脂的浓度。所述有机溶剂A、有机溶剂B为相同有机溶剤，均为乙腈和甲醇以体积比 1 0.25 9的混合液。所述有机溶剂A、有机溶剂B均为乙腈与甲醇以体积比的1 1.5混合液。步骤(1)所述油脂A与有机溶剂A体积比为1 0. 5 12。步骤⑵所述的硅胶柱处理为200g经105°C活化2h的硅胶GQ(K) 300目，青岛海洋化工有限公司)填充于3mmX400mm玻璃层析柱中，加入50 IOOg油脂B，真空吸附，收集流出液，得到的油脂B的脱胶油。步骤(3)所述ニ阶导数图谱S_7 在特征峰 1739CHT1，1241cm"1,1172cm"1,1090cm"1, 1020^,968^1进行差谱分析，优选IMlcnT1。进一歩，所述基于溶剂萃取耦合FIlR快速分析磷脂的方法，所述方法按以下步骤进行(1)将含200 5000ppm磷脂的油脂A用有机溶剂A萃取后，取上层萃取液A，采用 25 μ HiCaF2样品池，扫描次数32，在分辨率0. 5cm—1，波谱范围4000 ^OcnT1条件下记录波谱，记为3_5;所述有机溶剂A为乙腈与甲醇以体积比的1 1.5混合液；(2)另外取与油脂 A相同的油脂B，油脂B经硅胶柱脱磷脂处理后获得脱胶油B，将脱胶油B用有机溶剂B萃取， 取上层萃取液B，采用25 μ HiCaF2样品池，扫描次数32，在分辨率0. 5CHT1，波谱范围4000 400cm—1条件下记录波谱，记为S_4 ；所述有机溶剂B与有机溶剂A相同；(3)对S_4、S_5在特征峰1241cm—1处进行差谱分析，即S_5-S_4得到差谱S_6，对差谱S_6进行ニ阶求导并放大-10000倍，得到差谱的ニ阶导数图谱S_7，读取ニ阶导数图谱S_7在特征峰1241CHT1处的吸收强度；以含20 5000ppm的磷脂有机溶剂C溶液作为标准品，以有机溶剂C为參照， 在上述相同条件下测试波谱，并绘制标准曲线，根据标准曲线获得磷脂浓度；所述有机溶剂 C与有机溶剂A相同。所述标准曲线的绘制方法为①将有机溶剂C采用25 μ HiCaF2-品池，扫描次数 32，在分辨率0. 5CHT1、波谱范围4000 ^OcnT1条件下记录有机溶剂C的原始波谱，记为 S_0 ；②分别取磷脂添加至有机溶剂C中，制得浓度范围在20 5000ppm的磷脂标准溶液， 采用25 μ m CaF2样品池，扫描次数32，在分辨率0. 5cm—1、波谱范围4000 ^OcnT1条件下记录不同磷脂浓度标准溶液的波谱，分别记为波谱S_std_l S_std_n，η为大于1的自然整数；③对波谱S_0和系列波谱S_std_l S_std_n在特征峰处进行差谱分析，得到不同磷脂浓度下标准溶液的系列差谱D_1 D_n，η为大于1的自然整数，对系列差谱D_1 D_9 进行ニ阶求导并放大-10000倍，得到系列差谱D_1 D_9的系列ニ阶导数图谱S_2nd_l S_2nd_n，n为大于1的自然整数，读取系列ニ阶导数图谱S_2nd_l S_2nd_n中不同磷脂浓度标准溶液的各特征峰的吸收强度，以最大吸收峰强度为横坐标、标准磷脂含量为纵坐标，绘制标准曲线。所述磷脂特征峰为1739cm-1,1241cm-1,1172cm-1,1090cm-1,1020cm-1,968cm_1,优选 124 lcm_1o本发明所述脱胶油为脱除磷脂后的油脂。由于磷脂红外分析时最大误差来源于结构类似物甘油三酯的干扰，本发明采用溶剂萃取样品中的磷脂，其大部分中性甘油三酯等干扰物留在萃余相中，然后采用FIlR透射光谱分析萃取样品中磷脂含量。本发明所述有机溶剂A、有机溶剂B、有机溶剂C均为有机溶剤，为便于区分不同步骤所取原料及获得结果的不同而命名。与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在本发明方法操作简单，可连续操作，測定准确性好，精度高，灵敏，环境友好，操作安全，适于各种食用油的微量磷脂分析。
图1为溶剂萃取耦合FIlR分析大豆油中磷脂的红外图谱(实施例2)，其中1为乙腈溶剂原始图谱，2为甲醇溶剂原始图谱，3为体积比1 1的乙腈甲醇混合液的原始图谱，4为大豆油脱胶油的乙腈甲醇萃取液图谱；5为大豆油样品(PC浓度530ppm)的乙腈甲醇萃取液图谱；6是差谱S_6普通；7是差谱S_6的ニ阶导数图谱S_7。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一歩描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1 1.标准曲线的准备(1)分別取Sigma光谱级乙腈、甲醇，以体积比1 1制备乙腈甲醇混合液作为溶剂，采用25 μ m CaF2样品池，扫描次数32，分辨率0. 5cm—1，波谱范围4000 ^OcnT1记录原始波谱S_0 ；⑵分別取步骤⑴所述溶剂适量，添加磷脂酰胆碱(PC)标品(Sigma公司，美国)配制得到20，50，100，200，500，1000，1500，2000，5000ppm的磷脂标准溶液，利用红外波谱分析仪(TenSOr27，美国布鲁克光谱仪器公司)，采用25 μ m CaF2样品池，扫描次数32，分辨率0. 5CHT1，波谱范围4000 400CHT1记录系列标准样溶液的波谱，分别记为S_std_l、S_ std_2、S_std_3、S_std_4、S_std_5、S_std_6、S_std_7、S_std_8、S_std_9，然后分别做波谱减法运算即S_std-S_0得到系列差谱D_1 D_9，接着对系列差谱D_1 D_9进行ニ阶求导(5，5差分法)，并放大-10000倍，得到系列差谱0_1 0_9的ニ阶导数图谱S_2nd_l S_2nd_9，根据谱图，分别测量系列ニ阶导数图谱S_2nd_l S_2nd_9在968，1090，1172，1241， 1739cm—1处的吸收强度(不同吸收峰的基团归属见表1)，以系列ニ阶导数图谱S_2nd_l S_2nd_9在968，1090，1172，1241,1739cm—1处的吸收强度为横坐标、磷脂(PL)含量为纵坐标，得到相关标准曲线如表1 表1基于不同吸收波段定量的标准曲线
表1数据表明，基于上述5个波段定量的标准曲线线性关系均非常好，R2在 0.9994-1.0之间。尤其基于羰基吸收(YC = O)的标准曲线线性关系最好，标准差最小为 103，其次为1241cm—1波段，其相应标准差为163. 6，其他三个基团的标准曲线标准差均大于 300.考虑到油脂中磷脂的干扰物甘油三酯含有更多的C = 0，而P-O-C为磷脂特有的吸收峰，因此选择IMlcnT1波段定量。实施例2溶剂萃取耦合FIlR分析食用油样品中磷脂含量的方法(1)油脂的脱磷脂处理取200g经105°C活化2h的硅胶以200-300目，青岛海洋化工有限公司)填充于 3mmX400mm玻璃层析柱中，制备硅胶层析柱；分別取50-100g精炼大豆油(金龙鱼)和卡诺拉油(金龙鱼)，分別加入上述硅胶层析柱中，真空吸附，收集流出液，分別得到精炼大豆油脱胶油和卡诺拉油脱胶油。(2)溶剂萃取耦合FIlR分析食用油样品中磷脂含量的方法(a)准确移取10mL(9. 20g)精炼大豆油样品，置于30mL具塞玻璃管中，添加20mL 乙腈/甲醇1 1 (体积比)混合液(15. 80g)，密封，剧烈混合萃取lmin，静置30 60min 或4000rpm离心lOmin，取上相(溶剂层)0. 2ml，利用红外光谱分析仪(TenSOr27，美国布鲁克光谱仪器公司)进行分析，采用25ym CaF2-品池，扫描次数32，在分辨率0.5CHT1， 4000 400CHT1条件下记录红外光谱，记为S_5 ； (b)准确称取步骤(1)所述的硅胶柱处理得到精炼大豆油脱胶油，将脱胶油用与步骤(a)相同量及方法的乙腈/甲醇液混合液萃取， 取上相(溶剂层)0. anl，相同条件下測量上相的光谱，记为S_4 ； (c)对上述S_4与S_5作减法，即S_5-S_4，得到差谱S_6，然后对差谱S_6进行ニ阶求导(5，5差分法)，并放大-10000 倍，得到差谱S_6的ニ阶导数图谱S_7，測量ニ阶导数图谱S_7在1241CHT1最大吸收峰的吸收强度，带入实施例1获得的标准曲线得出萃取后溶剂中磷脂含量，再结合稀释倍数即可換算出原始样品中的磷脂含量(此处有机溶剂与油脂体积比为2 1，而換算时以质量计较为准确，因此萃取物水分含量需乘以萃取用乙腈的质量再除以样品油脂的质量样品磷脂的浓度=根据标准曲线获得的磷脂浓度X萃取溶剂的质量/样品的质量)，卡诺拉油中磷脂含量的測量方法与精炼大豆油相同，分別得出上述精炼大豆油和卡诺拉油中磷脂含量分别为 532ppm 和 468ppm。实施例3不同有机溶剂萃取分析大豆油磷脂含量的比较适宜的有机溶剤，首先应对磷脂有充分的溶解能力，以保障磷脂的完全萃取，同时对甘油三酯等干扰物溶解度尽量低，以减少波谱干扰。据此，在有机溶剂/油脂体积比为3 1条件下，分别比较了光谱纯的极性溶剂DMS0、甲醇、乙醇、乙腈的萃取效果，其他操作同实施例1，结果见表2。准确移取IOmL实施例2所述精炼大豆油脱胶油作为样品，置于30mL具塞玻璃管中，添加20mL不同的有机溶剂(见表2)，密封，剧烈混合萃取lmin,4000rpm离心IOmin, 取上相(溶剂层)0.加1，添加不同含量的磷脂(见表幻，利用红外光谱分析仪(TenSor27， 美国布鲁克光谱仪器公司)进行分析，采用25ym CaF2-品池，扫描次数32，在分辨率 0. 5CHT1，4000 ^OcnT1条件下记录红外光谱，分别记为S_5 ； (b)准确称取所述的硅胶柱处理得到精炼大豆油脱胶油，将脱胶油用与步骤(a)相同量及方法的有机溶剂萃取，取上相 (溶剂层)0. 2ml，相同条件下測量上相的光谱，记为S_4 ； (c)对上述S_4与S_5作减法，即 S_5-S_4,得到差谱S_6，然后对差谱S_6进行ニ阶求导(5，5差分法)，并放大-10000倍，得到差谱S_6的ニ阶导数图谱S_7，測量ニ阶导数图谱S_7在1241CHT1最大吸收峰的吸收强度，带入实施例1获得的标准曲线得出萃取后精炼大豆油中磷脂含量，再结合稀释倍数即可換算出原始样品中的磷脂含量，结果见表2。表2不同溶剂的萃取效果
权利要求
1.一种基于溶剂萃取耦合FIlR快速分析磷脂的方法，其特征在于所述方法为(1)将含200 5000ppm磷脂的油脂A用有机溶剂A萃取后，取上层萃取液A，在波谱范围4000 400CHT1检测红外波谱，记为S_5 ；所述有机溶剂A为乙腈、DMS0、甲醇、乙醇中的ー种或ー种以上的混合；(2)另外取与油脂A相同的油脂B，油脂B经硅胶柱处理后获得脱胶油B，将脱胶油B用有机溶剂B萃取，取上层萃取液B，在波谱范围4000 400CHT1检测红外波谱，记为S_4 ；所述有机溶剂B与有机溶剂A相同；(3)对S_4和S_5进行差谱分析，得到差谱S_6 的ニ阶导数图谱S_7，读取ニ阶导数图谱S_7在4000 400CHT1范围各特征峰的吸收强度， 根据磷脂标准曲线获得油脂A中磷脂的浓度。
2.如权利要求1所述基于溶剂萃取耦合FIlR快速分析磷脂的方法，其特征在于所述有机溶剂A、有机溶剂B均为乙腈和甲醇以体积比1 0.25 9的混合液。
3.如权利要求2所述基于溶剂萃取耦合FIlR快速分析磷脂的方法，其特征在于所述有机溶剂A、有机溶剂B均为乙腈与甲醇以体积比的1 1.5混合液。
4.如权利要求1所述基于溶剂萃取耦合FIlR快速分析磷脂的方法，其特征在于步骤 (1)所述油脂A与有机溶剂A体积比为1 0.5 12。
5.权利要求1所述基于溶剂萃取耦合FIlR快速分析磷脂的方法，其特征在于步骤(2) 所述的硅胶柱处理为将油脂B置于硅胶层析柱中，真空吸附，收集流出液，得到油脂B的脱胶油。
6.如权利要求1所述基于溶剂萃取耦合FIlR快速分析磷脂的方法，其特征在于步骤 (3)所述差谱分析是在特征峰1241cm—1处进行差谱分析。
7.如权利要求1所述基于溶剂萃取耦合FIlR快速分析磷脂的方法，其特征在于所述方法按以下步骤进行(1)将含200 5000ppm磷脂的油脂A用有机溶剂A萃取后，取上层萃取液A，采用25 μ HiCaF2样品池，扫描次数32，在分辨率0. 5cm—1，波谱范围4000 ^OcnT1 条件下记录波谱，记为3_5;所述有机溶剂A为乙腈与甲醇以体积比的1 1.5混合液；(2) 另外取与油脂A相同的油脂B，油脂B经硅胶柱脱磷脂处理后获得脱胶油B，将脱胶油B用有机溶剂B萃取，取上层萃取液B，采用25 μ HiCaF2样品池，扫描次数32，在分辨率0. 5^1, 波谱范围4000 400CHT1条件下记录波谱，记为S_4 ；所述有机溶剂B与有机溶剂A相同； (3)对S_4、S_5在特征峰IMlcnT1处进行差谱分析，即S_5-S_4得到差谱S_6，对差谱S_6 进行ニ阶求导并放大-10000倍，得到差谱S_6的ニ阶导数图谱S_7,读取ニ阶导数图谱S_7 在特征峰1241CHT1处的吸收强度；以含20 5000ppm的磷脂有机溶剂C溶液作为标准品， 以有机溶剂C为參照，在上述相同条件下测试波谱，并绘制标准曲线，根据标准曲线获得油脂A中磷脂浓度；所述有机溶剂C与有机溶剂A相同。
8.如权利要求1或7所述基于溶剂萃取耦合FIlR快速分析磷脂的方法，其特征在于所述标准曲线的绘制方法为①将有机溶剂C采用25 μ HiCaF2-品池，扫描次数32，在分辨率 0. 5CHT1、波谱范围4000 ^OcnT1条件下记录有机溶剂C的原始波谱，记为S_0 ；②分別取磷脂添加至有机溶剂C中，制得浓度范围在20 5000ppm的磷脂标准溶液，采用25 μ HiCaF2 样品池，扫描次数32，在分辨率0. 5CHT1、波谱范围4000 ^OcnT1条件下记录不同磷脂浓度标准溶液的波谱，分别记为波谱S_std_l S_std_n，n为大于1的自然整数；③对波谱S_0 和系列波谱S_std_l S_std_n在特征峰处进行差谱分析，得到不同磷脂浓度下标准溶液的系列差谱D_1 D_n，η为大于1的自然整数，对系列差谱D_1 D_n进行ニ阶求导并放CN 102539371 A大-10000倍，得到系列差谱D_1 D_n的系列ニ阶导数图谱S_2nd_l S_2nd_n，n为大于1 的自然整数，读取系列ニ阶导数图谱S_2nd_l S_2nd_n中不同磷脂浓度标准溶液的各特征峰的吸收强度，以最大吸收峰强度为横坐标、标准磷脂含量为纵坐标，绘制标准曲线。
全文摘要
本发明公开了一种基于溶剂萃取耦合FTIR快速分析磷脂的方法(1)将含200～5000ppm磷脂的油脂A用有机溶剂A萃取后，取上层萃取液A，在波谱范围4000～400cm-1检测红外波谱，记为S_5；(2)另外取与油脂A相同的油脂B，油脂B经硅胶柱处理后获得脱胶油B，将脱胶油B用有机溶剂B萃取，取上层萃取液B，在波谱范围4000～400cm-1检测红外波谱，记为S_4；(3)对S_4和S_5进行差谱分析，根据磷脂标准曲线获得油脂A中磷脂的浓度；本发明方法操作简单，可连续操作，测定准确性好，精度高，灵敏，环境友好，操作安全，适于各种食用油的微量磷脂分析。
文档编号G01N21/35GK102539371SQ20111041969
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月15日 优先权日2011年12月15日
发明者孟祥河, 潘秋月 申请人:浙江工业大学