一种预测结肠癌发病年龄的方法及试剂盒的制作方法

专利名称：：一种预测结肠癌发病年龄的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种预测结肠癌发病年龄的方法及试剂盒，更具体地说是通过测定人C53基因多态性位点1808T/C(rs2737)预测受试者可能的结肠癌发病年龄，该方法可用于疾病的辅助诊断、治疗和新药开发，属于医学生物技术和基因诊断领域。
背景技术：
：癌症是一种严重危害人类健康的疾病，是仅次于心脑血管病的第二号杀手。根据世界卫生组织(WHO)报告，每年年全球新发癌症病人大约900万，死亡超过500万人，过去的20年，癌症患病率增长了一倍以上。全球癌症仍呈上升趋势，据世界卫生组织专家预测，未来25年全世界80多亿人口中，将有3亿人患肿瘤，其中l亿人因癌症而死亡，21世纪癌症将成为人类健康的"第一杀手"。根据全国性死因回顾调査表明，20年来中国的癌症发病和死亡率逐年上升，每5个因病死亡的人中，就有l个是死于癌症，每200个家庭中，有1个家庭因有癌症病人而遭受磨难。2006年，中国癌症死亡人数300万，根据专家预测，到2020年，死亡人数将会超过400万。癌症不仅严重危害人类的身体健康，也给社会和家庭带来了沉重的经济负担(我国癌症每年耗费至少约2000亿元人民币)。结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，以40岁50岁年龄组发病率最高。据世界流行病学调查，结肠癌在北美、西欧、澳大利亚、新西兰等地的发病率最高，居内脏种瘤前二位，在中国的发病率与死亡率低于胃癌、食管癌、肺癌等常见恶性肿瘤。近年来各地资料显示随着人民生活水平的提高，饮食结构的改变，其发病率呈逐年上升趋势。中国的有关资料显示，结肠癌发病率占全部恶性肿瘤的第4位，而且有逐年增加的趋势。有数据显示，近年来，结肠癌中直肠癌多于结肠癌的情况有所改变，结肠癌的发病比例开始增加。虽然医疗条件不断改善，医疗技术也有很大提高，但结肠癌的发病率却一直上升，同吋其治疗及预后情况也仍然不容乐观，5年存活率不到60%。研究表明，在早期检测出结肠癌的病人，5年存活率达到90%;而晚期检测出的病人，5年存活率则只有35%。这充分说明了结肠癌的早期诊断对于其治疗和预后起着巨大的作用。结肠癌的检测，除了仪器设备，技术手段的改进，遗传因素的易感性也是目前世界上研究的热点之一。而遗传因素易感性的研究中，采用单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)作为基因组标志的关联分析方法是有效的。SNP是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的频率需>1%，SNP是双等位基因标记。由于生存的选择压力导致SNP在单一基因和整个基因组中的分布呈不均匀性。SNP在基因非编码区的数量是编码区的4倍，总数可达3百万个。SNP以其密度高，平均每lkb就有l个；代表性强，位于基因内部的SNP可能直接影响蛋白质结构或表达水平；遗传稳定性好，同微卫星多态性比较而言；易于自动化分析，因SNP在人群中为双等位基因标记，可简单以"+/-或1/0"直接分型，成为很好的遗传标志。作为本研究的候选基因，C53基因对于细胞的生长、迁移、粘附以及浸润都有重要的影响，有研究表明，C53基因与包括肺癌、肝癌、胃癌在内的多种癌症相关。而在已知的几个C53基因的SNP位点中，处于其mRNA的3'非翻译区(3'-UTR)的1808T/C由于处于microRNA379的结合区域而受到我们的关注。MicroRNA是近年来新发现的一类21—25nt长的单链小分子RNA。它广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，其本身不具有开放阅读框(ORF)。MicroRNA可以与编码基因的mRNA3'-UTR相结合，形成不完全的碱基配对，抑制mRNA的表达或是促进mRNA的降解。MicroRNA广泛地参与了生长发育的全过程，包括干细胞分化、血细胞形成、心脏和骨骼肌发育、神经发生、胰岛素分泌、胆固醇代谢和免疫应答反应等。同时MicroRNA也涉及一系列的疾病的病理生理过程，包括癌症和心脑血管疾病等。目前普遍认为，大概有30%的人类基因受到MicroRNA的调控。在MicroRNA与编码基因的mRNA3'-UTR结合的过程中，MicroRNA5'端的6~7个碱基对于结合的特异性起着决定性的作用，因此被称为"种子序列(seedsequence)"。因此与种子序列相对应的mRNA序列也就显得尤为重要，在这个序列内发生的碱基变化将直接影响MicroRNA与编码基因mRNA的结合，进而影响MicroRNA对基因的调控，而1808T/C正是处于这个区域内。通过实验，我们证实，1808T/C确实可以影响microRNA379与编码基因mRNA的结合。目前，国内外未见利用C53基因多态性预测结肠癌发病年龄的方法及试剂的相关报道。
发明内容本发明的第一个目的是提供一种预测结肠癌发病年龄的方法，以及这种方法在结肠癌的预防、辅助诊断和治疗中的用途。本发明的第二个目的是提供两种预测结肠癌发病年龄的试剂盒，第一种包括特异的PCR引物、限制性内切酶，以及含有上述引物和酶的试剂盒；第二种包括特异的PCR引物、LDR探针，以及含有上述引物和探针的试剂盒。为实现上述目的，本发明采取以下技术方案一种预测结肠癌发病年龄的方法，通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的C53基因3'-UTR+1808位点(对应NCBI的SNP库中标准编号分别是rs2737基因型，预测受试者结肠癌可能的发病年龄。一种分离核酸，是序列表SEQIDNO.l所示的碱基序列。本发明证实，C53基因型为AA纯合子时，受试者的易感性最高；增加结肠癌的风险为1.96倍。本发明中C53基因的单核苷酸多态性(SNP)具有SEQIDNO.l所示的核酸序列位点，是与结肠癌发病相关的高风险位点之一。一组预测结肠癌发病年龄的引物，能特异性地扩增出含C53基因的1808位点的扩增产物，是序列表SEQIDN0.2-SEQIDN0.3所示的碱基序列。一种预测结肠癌发病年龄的试剂盒，其由以下试剂组成30^110XPCR缓冲液，50^110mMdNTP混合液，20^15U/plTaqDNA聚合酶，各2|xl50pmoLVlF和R引物，10X酶切缓冲液，5pl10U尔1AccI内切酶，5ml纯水；F和R引物是序列表SEQIDN0.2-SEQIDN0.3所示的碱基序列；试剂盒的保存温度为-20。C。一种分离核酸，具有序列表SEQIDN0.4所示的碱基序列，该序列是与结肠癌发病相关的高风险SNP位点之一。一组预测结肠癌发病年龄的引物序列，能特异性地扩增出含C53基因的1808位点的扩增产物，是序列表SEQIDNO.5-SEQIDNO.6所示的碱基序列。一组预测结肠癌发病年龄的探针序列，是序列表SEQIDNO.7-SEQIDNO.9所示的碱基序列。一种预测结肠癌发病年龄的试剂盒，由以下试剂组成20nl10XHotStarPCR缓冲液，40pl10mMdNTP混合液，20pllOOmMMgS04溶液，5U/plHotStarDNA聚合酶，各2|il50pmol/nlF和R引物，0.5pl40U/plTaqDNA连接酶，10XTaqDNA连接酶反应缓冲液，10(^112.5pmol/|il/eachLDR探针混合物，2ml纯水；F和R引物是序列表SEQIDN0.5-SEQIDN0.6所示的碱基序列；LDR探针混合物是序列表SEQIDN0.7-SEQIDN0.9所示的碱基序列；试剂盒的保存温度为陽20。C。所述的LDR探针序列SEQIDNo.7的5'端磷酸化，3'端标记荧光染料FAM。本发明提供了两种预测结肠癌发病年龄的诊断试剂盒，其中含有本发明特异性扩增C53基因的PCR引物对，特异的限制性内切酶，以及用于PCR扩增进行LDR检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟知这些常规组件和检测方法。本发明的测定方法测定了来源于人的基因组DNA，样品没有限制如，体液(如血液、腹水和尿液)、组织细胞(如肝组织)等。通过提取和纯化这些样品可制备基因组DNA。本发明具有以下优点本发明首次阐明了C53基因多态性位点与结肠癌的相关性，提供了一种预测结肠癌发病年龄的方法，该方法可用于结肠癌的预防、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。我们使用了两种试剂盒对SNP1808T/C进行分析分别对应PCR-酶切分析法和新的LDR-PCR测序分型技术。传统的PCR-酶切分析试剂盒对实验平台要求较低，成本低廉，周期短。新的LDR-PCR测序分型试剂盒是利用高温连接酶实现对基因多态性位点的识别；高温连接酶一旦检测到DNA与互补的两条寡聚核苷酸接头对应处存在着基因点突变类型的碱基错配，则连接反应就不能进行，这种试剂盒操作简便、结果稳定、灵敏度和准确率高。下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。图1为C53基因在结肠癌组织中表达情况图谱。图2为报告载体荧光素酶活性分析图谱。图3为三种基因型(AA型，GG型，AG型)酶切图谱。图4为rs2737的LDR分型结果示意图图4-1为CT基因型，图4-2为CC基因型，图4-3为TT基因型。图5为SNP1808不同等位基因对结肠癌发病年龄的影响示意图。图6为低发病年龄组患者中不同等位基因型的分布频率图。具体实施方式实施例1:C53表达水平与结肠癌恶性程度密切相关一一人结肠癌组织芯片分析一.实验材料人结肠癌组织芯片(cc05-ll-005)购自西安超英生物科技有限公司，包含94个点，每个点均来自不同结肠癌病人的病理组织；免疫组化试剂盒购自北京中山生物公司。二.实验方法(一)免疫组化检测C53基因在人结肠癌组织中的表达水平1.C53抗体浓度1:200稀释2.阴性对照用一抗稀释液代替；3.实验详细染色步骤6(TC烤片30分钟，常规脱蜡水化；抗原修复以0.01MCB(柠檬酸盐缓冲液)(pH6.0)高压修复抗原，冷却至室温，PBS洗5分钟X2次；3XH202-甲醇封闭内源性过氧化物酶，室温10分钟，PBS洗5分钟X2次；滴加抗体，4°C冰箱过夜；0.1%Tween-PBS洗5分钟X3次；滴加聚合物增强剂，室温孵育20分钟；0.1%Tween-PBS洗5分钟X3次；滴加酶标抗鼠/兔聚合物，室温孵育30分钟；0.1%Tween-PBS洗5分钟X3次；DAB(3.3-四盐酸二氨基联苯胺)显色，蒸镏水洗终止显色；苏木素复染、水洗、分化后充分水洗返蓝；常规脱水透明，中性树胶封片；病理显微镜察片，按照着色深浅将C53基因表达水平分为高(3+)、中(2+)、低(1+)三个层次。(二)统计分析C53基因表达水平与结肠癌恶性程度的关系利用SPSS13.0软件，对C53基因表达水平与结肠癌分级以及浸润程度做线性相关分析。三.实验结果图1为C53基因在结肠癌组织中表达情况图谱。阴性对照为免疫组化试剂盒内的一抗稀释液，C53基因表达水平按照着色深浅分为高(3+)、中(2+)、低(1+)三个层次。_表1:C53基因表达水平与结肠癌恶性程度相关性分析_临床病理表型C53基因表达水平<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>统计结果显示，C53基因表达水平与结肠腺癌的分级有很强的相关性(Spearman相关系数=0.47,=0.0000001)，与结肠腺癌的浸润程度也有一定相关性(Spearman相关系数i.21,P《018)，而C53基因的表达水平与结肠粘液腺癌的恶性程度则没有相关性(P=0.12，0.37)。实施例2:结肠癌组织中microRNA379水平与C53基因表达水平呈负相关一.实验材料人结肠癌组织芯片(cc05-ll-006)购自西安超英生物科技有限公司，包含150个点，每个点均来自不同结肠癌病人的病理组织；microRNA379杂交探针为超英公司合成；原位杂交试剂盒购自碧云天生物技术研究所，C53抗体为本实验室自制(同实施例l);免疫组化试剂盒购自北京中山生物公司。二.实验方法(一)原位杂交检测microRNA379在人结肠癌组织中的表达水平80。C烤片15分钟；二甲苯I15分钟，二甲苯II15分钟；无水乙醇I5分钟，取出室温晾干；胃蛋白酶消化，37。C孵育10-30分钟或者显微镜下控制；梯度乙醇，室温凉干；设置阳性阴性对照(阳性对照为U6的探针，阴性对照为一段无义的RNA序列探针)；杂交探针用杂交液稀释至10ng，滴加于组织块(或组织芯片)，37'C水浴过夜；TTBS(0.1。/。(V/V)Tween20(溶于Tris盐缓冲液)Tris盐缓冲液10Ommol/LTrisCL,PH7.50.9%(m/V)NaCl)溶液冲洗3次，每次10分钟；滴加抗体，37摄氏度孵育30-50分钟；TTBS溶液冲洗，脱色摇床上10分钟X3次；稀释50倍BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸对甲苯胺盐/氯化硝基四氮唑蓝)显色液，避光显色2-4小时；蒸馏水终止显色，置于脱色摇床上5分钟；复染，30ul/片，盖上盖玻片，显色3-5分钟；蒸熘水冲洗，置于摇床上15—30分钟；梯度乙醇，室温凉干；二甲苯115分钟。二甲苯1115分钟；中性树胶封片；病理显微镜察片，按照着色深浅将microRNA379表达水平分为高(2+)、低(1+)两个个层次。(二)免疫组化检测C53基因在人结肠癌组织中的表达水平实验方法同实施例1。(三)统计分析结肠癌组织中microRNA379水平与C53水平的相关性利用SPSS13.0软件，对C53基因表达水平与结肠癌分级以及浸润程度做线性相关分析。三.实验结果表2:结肠癌组织中microRNA379水平与C53基因表达水平的相关性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>统计结果显示，结肠癌组织中microRNA379水平与C53基因表达水平呈负相关(相关系数=-0.192，OR值K).37，95%可信区间=0.15-0.86，P=0.018)。此结果表明C53基因确实与microRNA379相结合。实施例3:C53基因1808位点不同基因型对microRNA379结合活性的影响一.实验材料1.生物材料人结肠癌细胞系HCT116购自中国医学科学院基础研究所细胞中心;pMIR-Report载体、microRNA379前体以及对照购自Ambion公司；内参pRL-CMV质粒购自Promega公司。2.工具酶及常用试剂Lipofectamine2000(LF2000)、DMEM、Opti-MEMI、FetalBovineSerum购自GIBCOBRL公司；Dual-luciferaseReporterAssay试剂盒购自Promega公司；EndoFreePlasmidMaxiKit购自QIAGEN公司；其余试剂均为进口或国产分析纯。3.按照常规方法配制下列试剂并灭菌磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)、DMEM高糖培养基、LB培养基、溴化乙锭(EB)溶液(10mg/ml)、TE缓冲液。二.实验方法1.载体构建依本领域常规操作，将设计好的带有C53基因1808位点不同基因型的单链DNA片段退火，并与经过Spel和HindIII双酶切的pMIR-Report载体相连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a，酶切筛选得到携带不同基因型的报告系统载体(pMIR-CC，野生型和pMIR-TT，突变型)。带有C53基因1808位点不同基因型的单链DNA片段由奥科公司合成野生型序列CTGTGGTGATTGGCCCTGTGGTCTACCAGGAAGCTT-3';(SEQIDNo.10)禾口CGACACCACTAACCGGGACACCAGATGGTCCTTCGAA-3';(SEQIDNo.11)突变型序列CTGTGGTGATTGGCCCTGTGGTCTATCAGGAAGCTT-3，(SEQIDNo.12)和CGACACCACTAACCGGGACACCAGATAGTCCTTCGAA陽3'(SEQIDNo.13)。2.大量提取无内毒素的质粒DNA:挑单克隆菌落于5mlLB中(kana+)，37°C、300rpm振摇8小时，按1:500的比例稀释至100ml,37°C，300rpm振摇1216小时；6,000rpm，4。C离心15分钟，收获细菌，倒尽上清；将细菌重悬于10mlBufferPl(含RNaseA100吗/ml)，加1OmlBufferP2，轻轻颠倒混匀46次，室温放5分钟。准备QIAfilterCartridge:把盖放到QIAfilterMaxiCartridge上，并将Cartridge放在一管上；加10ml预冷的BufferP3，轻轻颠倒混匀46次，将裂解液移入QIAfilterCartridge中，室温放置10分钟，过滤至50ml管中；力n2.5mlBufferER，颠倒混匀10次，放冰上30分钟；(以下操作在超净台中操作)用10mlBufferQBT平衡QIAGEN-tip500，将过滤后的裂解液加入tip中，使其自然流下，加30mlBufferQC洗QIAGEN-tip两次，用15mlBufferQN洗脱DNA，并用无菌管收集；加10.5ml(0.7V)异丙醇沉淀DNA,混匀，11,000rpm，4。C离心30分钟；用5mlEndotoxin-free的70%乙醇洗DNA沉淀，ll,OOOrpm离心10分钟，弃上清，空气中干燥；重溶于endotoxin-free的TE中。3.细胞转染分别用250plOpti-MEMI稀释4pg质粒DNA和10^1Lipofectamine2000，室温放置5分钟；将前两者混合，室温放置20分钟；用生理盐水洗涤细胞，加入1.5ml无抗含10%小牛血清的DMEM培养基；20分钟后，向混合液中加500pl无抗含10%小牛血清的DMEM培养基，混匀后加入细胞中，置37°C、5%032培养箱内5-6小时之后换为1%血清的DMEM继续培养。4.荧光素酶活性检测用脂质体Lipofectamine2000，分别将pMIR-CC或pMIR-TT与microRNA379前体或对照，以及内参pRL-CMV共转染入结肠癌HCT116细胞，24小时后，弃培养基，用PBS洗一次，去掉PBS;加30(HdlxPLB，在摇床上室温孵育15分钟，使细胞完全裂解；将裂解液移入1.5ml离心管中离心，去掉沉淀；取lOOulLARn及2(Hil裂解液至荧光管中，混匀；测量萤火虫荧光素酶的活性；再加入lOOplStop&GolReagent,测量海胆荧光素酶的活性。三.实验结果图2为报告载体荧光素酶活性分析图谱。携带C53SNP1808CC基因型的报告载体(pMIR-CC)，转染microRNA379前体与转染microRNA对照组相比较，转染microRNA379前体组的荧光素酶的活性下降了43%，(P-0.015);携带C53SNP1808TT基因型的报告载体(pMIR-TT)，转染microRNA379前体与转染microRNA对照组的荧光素酶活性则没有明显的差异(P=0.86)。此结果说明，不同基因型能够显著地影响C53基因与microRNA379的结合活性。实施例4:预测结肠癌发病年龄的试剂盒及方法(PCR-RFLP法)PCR扩增的目的片段为序列表SEQIDNO.l所示的碱基序列；PCR引物为序列表SEQIDNO.2-3所示的碱基序列；各种限制性内切酶、TaqDNA聚合酶等均为TaKaRa或NEB公司产品；其余各种试剂为进口或国产分析纯试剂。一.试剂盒成分30^1IOXPCR缓冲液；(100mMTris-HCl(pH8.3)，500mMKCl，15mMMgCl2)50^110mMdNTP混合液；(dATP，dCTP，dTTP，dGTP各2.5mM)20^15U小1TaqDNA聚合酶；各2^150pmol/nlF和R引物:F引物5'-CAAGAACCCCACGAAAACAG-3'(SEQIDN0.2)R引物5'-AAGATGGAAAGCCACAGGAA-3'(SEQIDN0.3)30^1IOX酶切缓冲液；(50mMKAc，20mMTris-Ac,10mMMg(Ac)2，1mMDTT(pH7.9))5pl10U尔lAccI内切酶；5ml超纯水(ddH20);本试剂盒供IO人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20。C。二.使用方法1.PCR扩增目的片段PCR扩增条件总反应体系为10ial，包括20ng基因组DNA1.0pl(提取方法见实施例6)，PCR引物(5pmol/|Lil)各0.6^1，dNTP混合液(10mmol/L)0.2)iil，10xPCR缓冲液(含15mmol/LMg2+)1.0pl，Taq聚合酶(5U/pl)0.1|il，用灭菌蒸馏水(纯水、ddH20)补充至10pi。PCR反应参数首先95t:变性10分钟，随后迸行35个循环，每一循环包括94"变性30秒，在相应的退火温度退火30秒，72t:延伸40秒。最后，72'C延伸10分钟，4t:保存。所用的PCR循环仪是ABI公司的PE9700型。扩增序列为SEQIDNO.l:序列的第147位即为该SNP的位点，有A/G两种基因CGCTATACTAACTAGAAGGAGAATCTGTGGTTTTCGCCTG回TAGACCACAGGGCCCCGCTTCCTTCCTGTGGCTTTCCATCTT2.限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分型(1)SNP1808(rs2737)的酶切位点TGTGGTTTTCGCCTG回TAGACCACAGGGCCAATCACCACA个AccI(GTAGAC)TGTGGTTTTCGCCTGgTAGACCACAGGGCCAATCACCACA下划线表明的是限制性内切酶Accl的识别序列，箭头和大写字是SNP的等位基因。AA基因型的扩增片段不存在Accl酶切位点，将出现一个244bp片段；GG基因型存在AccI酶切位点，将出现147bp和97bp两个片段；AG基因型则产生244bp、147bp和97bp三个片段。(2)PCR产物酶切体系(20^1):PCR产物8.0plIOX酶切缓冲液2.0^1Accl(lOU/pl)0，ddH209，(3)37'C温育3小时后，加入IOX上样缓冲液lpl终止反应；(4)取8nl上述产物，4.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。图3为三种基因型(AA型，GG型，AG型)酶切图谱。该试剂盒的优点是对实验平台要求较低，对技术人员也没有特殊的技术要求，只要接受简单的分子生物学操作培训即可；成本低廉，检测所需时间短。实施例5:预测结肠癌发病年龄的试剂盒及方法(PCR-LDR法)PCR扩增的目的片段为序列表SEQIDN0.4所示的碱基序列；PCR引物为序列表SEQIDNO.5-6所示的碱基序列；LDR探针为序列表SEQIDNO.7-9所示的碱基序列；为各种限制性内切酶、T叫DNA聚合酶等均为TaKaRa或NEB公司产品；其余各种试剂为进口或国产分析纯试剂。一.试剂盒成分20^110XHotStarPCR缓冲液；(lOOmMTris陽HCl(pH8.3)，500mMKCl，15mMMgCl2，100吗/mlBSA)40^110mMdNTP混合液；(dATP，dCTP，dTTP，dGTP各2.5mM)2(^1lOOmMMgS04溶液20|xl5U/plHotStarDNA聚合酶；各2pl50pmol/plF和R引物F引物5，-GAAGATGGAAAGCCACAGGA-3'(SEQIDN0.5)R引物5'-TCAACTGCAGGCTCAGAGAA-3'(SEQIDN0.6)0.5^140U1TaqDNA连接酶；10pllOXTaqDNA连接酶反应缓冲液；lOjul12.5pmol/pl/eachLDR探针混合物(探针用SYBRGreen荧光染料进行标记)5，-TTTTTTTTTTTTTTTTAGGAGAATCTGTGGTTTTCGCCTGG-3'(SEQIDN0.8)2ml超纯水(ddH20);本试剂盒供IO人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20。C。二.使用方法1.通过PCR扩增含有所检测的SNP位点的DNA片段表3:PCR系统(2(^1体系)组分浓度体移模板(实施例6制备的基因组DNA)HotStarPCR缓冲液10X2^1dNTP混合液10mM2plMgS04lOOmMO如lHotStarDNA聚合酶5unit/pi0.2nlF引物50pmol/(il0.2plR引物50pmol/[il0.2nl超纯水9単PCR反应参数95°C5分钟94°C30秒35个循环—65°C30秒^72°C1分钟72°C7分钟PCR产物检测用3n/。的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,观察PCR反应的效果，并确定其作为模板在LDR反应中加入的量。2.通过LDR反应测定C53基因SNP+1808多态性LDR系统(10pl体系)组分浓度体积PCR产物lplg/|al1^1TaqDNA连接酶缓冲液10X1^1TaqDNA连接酶40，0,05nl探针混合物12.5pmol/[al/eachlpl超纯水6.95mlLDR反应参数95°C35个循环」94°C60°C测序仪ABIPRISM3100。SEQIDN0.4:序列的第99位即为该SNP的位点，有C/T两种基因型,2分钟30秒2分钟,CAGGCGA图4为LDR分型结果示意图。该试剂盒的优点是操作简便、结果稳定、灵敏度和准确率高'实施例6:基因组DNA的提取共计收集结肠癌患者222例，平均年龄58.97土13.87岁，其中男性占57.2%。所有受检者均为汉族，且签署知情同意书，这一研究也得到了伦理委员会批准。根据下列方法，用人外周血制备基因组DNA。在抗凝剂EDTA存在下，将收集的10ml人外周血在2500rpm，离心分离30分钟除去血清。接着加入0.2%NaCl溶液，使总体积为50ml。轻轻振荡溶液5-6次，并使其放置于冰上15分钟。此后，在2500rpm离心分离30分钟，借此收集沉淀物。用0.2。/。的NaCl溶液，以类似于前面的方式再进行洗涤。在如此获得的沉淀物中，加入10mMTris-HCl(pH8.0)和10mMEDTA(4ml)，以悬浮该沉淀物。将10%SDS，25mg/ml的蛋白酶K和10mg/ml的RNaseA加入悬液中，其加入量分别为4ml、16^1和20^1，接着上下颠倒悬液轻轻混合。然后，在37"C过夜温育悬液。过夜后，加入4ml酚/Tds溶液，上下颠倒混合物混合所得的混合物。以3000rpm进行离心分离IO分钟除去水层。将水层和4ml酚/氯仿溶液混合，接着颠倒混匀并以3000rpm离心分离IO分钟。除去水层。最后，用氯仿提取两次，以获得水相，往其中加1/10体积的3MNaAC(pH5.2)，两倍量的冷无水乙醇，使DNA沉淀。用70%的乙醇洗涤以获得基因组DNA。基因组DNA溶解于TE中，然后定量测定混合物在260nm的吸收率。DNA工作液浓度校正至30ng/|xl，置-20°C冰箱保存。实施例7:C53SNP1808基因型对结肠癌发病年龄的影响一.实验方法1.测定C53SNP1808多态性位点基因型分别采用实施例4和实施例5所述的试剂盒和方法对实施例6提取得到的结肠癌患者基因组DNA样本进行检测。2.统计方法利用SPSS13.0软件进行分析，检验Hardy-Weinberg平衡检测，数量变量采用t检验，质量变量采用卡方检验。双侧P〈0.05认为统计学的差异显著。采用ANOVA检验计算不同基因型对结肠癌的发病年龄的影响。二.实验结果经检测分析得到，不同基因型对结肠癌的发病年龄的影响图5为SNP1808不同等位基因对结肠癌发病年龄的影响示意图。在222例结肠癌患者中，携带CC基因型的患者平均发病年龄为55.3岁，而携带TT基因型的患者平均发病年龄为63.0岁(95%可信区间=2.6到12.8岁，P=0.003)。可见，C53的1808基因多态性显著影响了结肠癌的发病年龄。图6为低发病年龄组患者中不同等位基因型的分布频率图。CC基因型在45岁以下发病年龄患者中的分布频率为io.8%，远远低于其在整个患病人群中的分布频率(26.6%)。本发明具有实用性的例证1)本发明的C53基因多态性的检测方法可用于分析C53基因上的SNP1808位点的多态性，应用在对结肠癌的辅助性诊断和对个体可能的结肠癌发病年龄进行评估。以利于开展结肠癌的早期干预和治疗。2)利用本发明阐述冠结肠癌心病基因的多态性，作为生物标志物之一，可用作药物设计的分子靶标的筛选，以帮助寻找具有调节C53表达的活性分子，促进结肠癌新药的开发。3)本发明建立的检测C53基因多态性的核酸序列和结肠癌相关位点，可高灵敏度、特异性地应用于结肠癌基因诊断用的试剂盒。如上所述，得出结论，C53基因的多态性与结肠癌的发病年龄具显著相关性。因此，根据本发明，测定多态性可用于进行基因诊断。本发明叙述了C53基因结肠癌相关的SNP位点，并提供了一种测定C53基因多态性的方法。而且，根据本发明，只需要少量DNA样品就足以测定C53基因的多态性。结果，本发明提供了一种测定结肠癌相关基因多态性的基因诊断方法。序列表〈110〉中国医学科学院阜外心血管病医院〈120〉一种预测结肠癌发病年龄的方法及试剂盒〈130〉<160〉13<170>Patentlnversion3.5<210〉1〈211>244<212>画<213〉人属，人种〈220〉〈221>SNP位点〈222〉(147)<223>r:a或g〈400>1caagasccccacga^已C3ggtgcgaagcctcaactgc已ggctcag已gaagcagcataag60gaactgtcagtactgaagcaagagttttttcctcttttattaagtccgctatactaacta120ctgtggttttcgcctgrtagaccacagggcc犯tcaccacagcttcttgt180g卿gtgccac鄉tgccgcttccttcctgtggctttcca240tctt244〈210〉2〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工合成〈400〉2caagaaccccacgaaaacag20〈210〉3〈211〉20〈212〉腿<213〉人工合成〈400〉3aagatgga犯gccacaggaa20〈210〉4〈211〉215<212〉DNA〈213〉人属，人种〈220〉〈221〉SNP位点<222>(99)〈223〉y=t或c〈400〉4gaagatggaaagccacaggaaggaagcggcacctgatggtgatcttggcactctccatgt60tctctacaagaagctgtggtgattggccctgtggtctaycaggcgaaaaccacagattct120ccttctagttagtatagcggactt犯taaaagaggaaaaaactcttgcttcagtactgac180agttccttatgctgcttctctgagcctgcagttga215〈210〉5〈211〉20〈212〉腿<213>人工合成<400〉5g犯gatggaaagccacagga20〈210〉6〈211>20<212>DNA〈213>人工合成〈400〉6tcaactgcaggctcagagaa20〈210〉7<211〉41〈212〉DNA〈213〉人工合成<400〉7tagaccacagggccaatcaccacagtttttttttttttttt41〈210〉8〈211〉41〈212〉醒〈213〉人工合成〈400〉8ttttttttttttttttaggagaatctgtggttttcgcctgg41〈210〉9〈211〉43〈212〉DNA〈213〉人工合成〈400〉9ttttttttttttttttttaggagaatctgtggttttcgcctga43〈210〉10〈211〉87<212〉DNA〈213〉人工合成〈400〉10actagtgcacctgatggtgatcttggcactctccatgttctctacaagaagctgtggtga印ttggccctgtggtctaccaggaagctt8了<210>11〈211〉87〈212〉腿<213〉人工合成〈400〉11tgatcacgtggactaccactagaaccgtgagaggtacaagagatgttcttcgacaccact60aaccgggacaccagatggtccttcgaa87<210〉12〈211〉87〈212〉DNA〈213>人工合成〈400〉12actagtgcacctgatggtgatcttggcactctccatgttctctacaagaagctgtggtga60ttggccctgtggtctatcaggaagctt87<210〉13〈211〉87〈212〉DNA〈213〉人工合成<400>13tgatcacgtggactaccac"tagaaccgtgagaggtacaagagatgttcttcgacacceict60aaccgggacaccagatagtccttcgaa8权利要求1.一种预测结肠癌发病年龄的方法，其特征在于该方法通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的C53基因1808位点(rs2737)的基因型，预测受试者可能的结肠癌发病年龄。2.—种分离核酸，是序列表SEQIDNO.l所示的碱基序列。3.—组预测结肠癌发病年龄的引物，能特异性地扩增出含C53基因的1S08位点的扩增产物，是序列表SEQIDNO.2-SEQIDN0.3所示的碱基序列。4.一种预测结肠癌发病年龄的试剂盒，其特征在于由以下试剂组成30^1IOXPCR缓冲液，50pl10mMdNTP混合液，20^15U/VTaqDNA聚合酶，各2pl50pmol/pilF和R引物，3C^110X酶切缓冲液，5pl10U/plAccI内切酶，5ml超纯水；F和R引物是序列表SEQIDN0.2-SEQIDN0.3所示的碱基序列；试剂盒的保存温度为-20。C。5.—种分离核酸，具有序列表SEQIDN0.4所示的碱基序列。6.—组预测结肠癌发病年龄的引物序列，能特异性地扩增出含C53基因的1808位点的扩增产物，是序列表SEQIDNO.5-SEQIDNO.6所示的碱基序列。7.—组预测结肠癌发病年龄的探针序列(寡核苷酸序列)，是序列表SEQIDNO.7-SEQIDN0.9所示的碱基序列。8.—种预测结肠癌发病年龄的试剂盒，其特征在于由以下试剂组成20pllOXHotStarPCR缓冲液，lOmMdNTP混合液，20jillOOmMMgS04溶液，20pl5U/plHotStarDNA聚合酶，各2pl50pmol/|alF和R引物，0.5(^140U/|iilTaqDNA连接酶，10^1lOXTaqDNA连接酶反应缓冲液，lOpl12.5pmol/nl/eachLDR探针混合物，2ml超纯水；F和R引物是序列表SEQIDNO.5-SEQIDNO.6所示的碱基序列；LDR探针混合物是序列表SEQIDNO.7-SEQIDNO.9所示的碱基序列；试剂盒的保存温度为-20。C。9.根据权利要求8所述的预测结肠癌发病年龄的试剂盒，其特征在于所述的LDR探针序列SEQIDNo.7的5'端磷酸化，3'端标记荧光染料FAM。全文摘要本发明涉及一种预测结肠癌发病年龄的方法及试剂盒，属于医学生物技术和基因诊断领域。一种预测结肠癌易感性的方法，通过提取宿主细胞基因组DNA，测定受试者的C53基因多态性1808位点(rs2737)的基因型，预测受试者对结肠癌的易感性。本发明的优点是首次阐明了C53基因多态性位点与结肠癌发病年龄的相关性，提供了一种预测结肠癌易感性的方法，该方法可用于结肠癌的预防、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。文档编号C12N15/11GK101245393SQ200810102699公开日2008年8月20日申请日期2008年3月25日优先权日2008年3月25日发明者晖于,凯孙,张禅那,惠汝太,涛杨,毅石,陈敬洲申请人:中国医学科学院阜外心血管病医院