专利名称：：一株丙酮丁醇梭菌及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一株丙酮丁醇梭菌及其应用。技术背景丁醇(Butanol)是一种重要的化工原料，主要用于制造增塑剂、溶剂、萃取剂等。丁醇又是一种极具潜力的新型生物燃料，其热值、辛垸值与汽油相当；含氧量与汽油中常用的甲基叔丁基醚相近；不会腐蚀管道，便于管道输送；蒸汽压低，安全性高，且能与汽油以任意比混合。丁醇可由发酵和石油化工合成法生产。发酵法生产丙酮丁醇(又称ABE发酵)曾经是仅次于乙醇的全球第二大发酵工业。化学合成法有两种，以丙烯为原料的羰基合成法，以乙醛为原料的聚合法。20世纪50年代以后，由于石化合成技术的成熟导致发酵法生产丁醇不再具有经济竞争优势，丁醇发酵逐渐淡出市场。70年代后，随着石油危机的出现及国际原油价格的不断上涨，世界各国对能源安全和资源安全的忧虑日增，人们又重新开始关注丁醇的发酵生产。并在随后的研究过程中积累了大量的相关资料，详尽阐明了丙酮丁醇梭菌的代谢途径，进行了丙酮丁醇梭菌的分子生物学研究，并且开发了用于丙酮丁醇梭菌的遗传操作系统，改造了丁醇的生产工艺和回收工艺等，取得了很大的研究进展。但仍有以下困扰丁醇生产的难题存在:第一，底物费用高昂，发酵用的基质占丁醇生产成本的70%左右；第二，产物浓度低，由于丁醇的毒性，导致发酵过程中产物浓度很低，总溶剂不到2%;第三，产物回收费用高，由于产物浓度太低，故回收需要大量耗能。传统的发酵法生产丙酮丁醇是以玉米或糖蜜为基质，接入丙酮丁醇菌种进行发酵，其发酵产物为丙酮，丁醇和乙醇，且比例为3:6:1，丁醇所占溶剂的比例约为60%，丁醇占总溶剂的比例不高。因此提高丁醇在溶剂中的比例具有重要的意义，但现有技术偏重于发酵工艺的改进，如吸附法固定化细胞直接发酵淀粉质原料生产丙酮丁醇的方法(CN87103534A)，该方法将处于对数期的丙酮丁醇梭菌吸附固定，然后用固定化细胞直接发酵淀粉质原料生产丙酮丁醇溶剂。该项发明采用传统的菌种，丁醇在产物中的比例仅为60%左右，不能达到本发明菌株在发酵中达到的高丁醇的比例。专利高丁醇比丙酮丁醇梭菌及其培养方法与应用(CN95111733.5)，虽然该专利通过多轮化学诱变，得到了一株丁醇比例较高的菌株，其不足之处在于菌株经过多轮诱变之后，其生长特性受到影响，菌株稳定性下降，如该菌株不能用传统的保藏和复壮方法。另外应用化学诱变剂获得的菌株可能出现回复突变，且回复突变的几率可高达l(T2。因此上述方法不能从根本上解决上述问题，因此亟待获得稳定的高产和高比例丁醇的菌株。本发明提供了一株野生型的丙酮丁醇梭菌，其突出的优势在于该菌株与传统的野生型菌株不同，具有较高的丁醇比例。该菌株发酵产生丁醇在溶剂中的比例能够达到75%，远高于传统的60%，具有重要的工业应用价值。
发明内容本发明的目的是提供一株丙酮丁醇梭菌及其应用。本发明所提供的丙酮丁醇梭菌为丙酮丁醇梭菌(C/o^W誦flc柳6^y"c調)SB-1CGMCCW,2287。所述丙酮丁醇梭菌(C/o欲Wwmfl"to^(y/z'cww)SB-1CGMCCWs.2287具有在发酵过程中产生的丁醇占总溶剂的重量比达68-75%的特性。所述丙酮丁醇梭菌(C/o拚Wwmflceto^(y//cMm)SB-1CGMCC来源于云南腾冲温泉附近植物根际土壤。电镜照片显示(见图1)，丙酮丁醇梭菌(C/o^^Z/t^flce/oZm/y//cwm)SB-1CGMCCWs.2287营养细胞的形态呈两端圆形短杆状，单一或双联，有鞭毛，可运动，细胞有2.6-4.7X0.5~0.7微米，革兰氏染色呈阳性。所述丙酮丁醇梭菌(C/oWn'Wwmaceto6^y"cwm)SB-1CGMCCJ^.2287，已于2007年12月11日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为.*中国北京市海淀区中关村北一条13号)，保藏号为CGMCCW.2287。本发明的丙酮丁醇梭菌(C7oWWWwwaceto6wzy//cwm)SB-1CGMCCWs.2287可用于发酵生产丁醇，具体方法可为所述发酵生产丁醇的方法是将所述丙酮丁醇梭菌(C/asfrWwwflceto6"0^cwm)SB-1CGMCC接种到发酵培养基中，于35-39°C，静止发酵得到丁醇溶液。所述发酵培养基为含淀粉的培养液；所述含淀粉的培养液优选为含玉米淀粉的培养液。所述含玉米淀粉的培养液中的玉米淀粉的质量百分含量为8%。所述发酵培养基中还含有质量百分含量为0.3%的乙酸钠或丁酸钠。所述发酵的温度优选37X:。所述丙酮丁醇梭菌(C/a^Wwmaceto6"0^'c"m)SB-1CGMCC初始菌液浓度为109—1()Ucfu/mL。所述接种是将生长至对数期的丙酮丁醇梭菌(C/a^Wwmaceto6w^&"一SB-1CGMCC地2287按照体积百分含量为5-10%的接种量接种到所述发酵培养基中。所述生长至对数期的丙酮丁醇梭菌(C/oWrWwmacetoZm/y/Zcwm)SB-1CGMCC按照体积百分含量为5%的接种量接种到所述发酵培养基中。以上述丙酮丁醇梭菌(C/a^nV//wwflcetoZm(y//cwm)SB-1CGMCC2287为活性成分的生物菌剂也属于本发明的保护范围；该菌剂中可根据需要，添加可接受的辅料。本发明的丙酮丁醇梭菌(C7oWnWwmaceto^(y//ram)SB-1CGMCCW2.2287，发酵生产丁醇，发酵生产所得的溶剂中丁醇重量比例达68-75%。图1为丙酮丁醇梭菌(C/oWnW/Mmflceto^O^'cwm)SB-1CGMCC的扫描电镜照片具体实施方式下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例l、丙酮丁醇梭菌(C/o败Wwmaceto^O^cwm)SB-1的分离、纯化及其鉴定1、丙酮丁醇梭菌(C/os/rWwwac"o6M^//ci/m)SB-1的分离及纯化七八月份采集云南腾冲温泉附近植物根际的土样40份。将土样分别加入装有lOmLRCM培养基(培养基组成每升培养基含酵母粉3.0g，蛋白胨10.0g,牛肉膏10.0g，葡萄糖5.0g,淀粉10.0g,乙酸钠3.0g,L-半胱氨酸盐酸盐0.5g,丁醇，pH6.8)的厌氧管中，混合后，在10(TC沸水中加热90S，杀死营养体细胞，于37。C温箱中培养。定期观察，挑出有气泡产生的厌氧管，应用亨盖特滚管技术，分离单菌落。将单菌落挑出扩培后，转移玉米粉培养基(质量百分含量为7%的玉米粉溶液)，37t:培养，观察发酵现象，挑出有醪盖形成的试管，总共得到产丁醇的菌株105株。对这些菌株在玉米粉培养基(质量百分含量为7%的玉米粉溶液)中，37'C进行重新发酵，对发酵醪进行液相色谱分析，比较各菌株的溶剂总产量和丁醇的比例，经发酵筛选，选出一株发酵速度快，产生的丁醇比例高的菌株命名为SB-1。SB-1的电镜照片如图1所示，SB-1营养细胞的形态呈两端圆形短杆状，单一或双联，有鞭毛，可运动，细胞有2.6-4.7X0.5~0.7微米。SB-1的生理生化特征鉴定按照伯杰氏细菌鉴定手册进行，结果见表l。表l.SB-l的生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>对SB-1进行了16SrDNA序列扩增，测序表明，SB-1的16SrDNA序列具有序列表中序列1的核苷酸序列，并在NCBI网站上进行BLAST比对。结果表明，SB-1的16SrDNA序列ClostridiumacetobutylicumATCC824(U16166.1)的16SribosomalRNA(rrn)gene的同源性为100%，与ClostridiumacetobutylicumVKPMB-4786(AM231184.1)、Clostridiumacetobutylicum6MSU(AM231182.1)、Clostridiumacetobutylicum7MSU(AM231183.1)16SrRNA的同源性均为99%。从比对的结果可以看出，菌株SB-1为丙酮丁醇梭菌。根据厌氧生长的特性，产物分析结果，16SrDNA序列比对，可以确定筛选出的菌株为丙酮丁醇梭菌(C7oyW^'"macetoZw/y"cww)，命名为丙酮丁醇梭菌(aosfr^/ww丙酮丁醇梭菌(C/a^WwmacetoZ)i^//c"w)SB-1已于2007年12月11日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCCW.2287。实施例2、利用丙酮丁醇梭菌(C/a^WwwacetoZm(y//cMm)SB-1CGMCCW2.2287生产丁醇将丙酮丁醇梭菌(aasfrW/Mwaceto6^y//cwm)SB-1CGMCC用RCM培养基(培养基组成每升培养基含酵母粉3.0g,蛋白胨10.0g,牛肉膏10.0g,葡萄糖5.0g,淀粉10.0g，乙酸钠3.0g,L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，pH6.8)与37。C温箱中静置培养至对数期，作为发酵种子液。将上述获得的发酵种子液按照体积百分比为5%的量接种到装有3L玉米粉培养基(含有质量百分含量为8%的玉米粉的培养液)的7L发酵罐中进行发酵，发酵温度为分别为35"C，37°C，39°C，发酵方式为静止发酵；发酵时间为48小时。将发酵后的发酵液用液相色谱检测各种有机溶剂含量，结果如表2所示。表2.SB-1在不同温度下的溶剂产量(g丄勺和丁醇比例<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例3、利用丙酮丁醇梭菌(C/o欲W"mGceto^(y"cwm)SB-1CGMCC生产丁醇将丙酮丁醇梭菌(C/ayWt//"wac^o^O^cww)SB-1CGMCC用RCM培养基(培养基组成每升培养基含酵母粉3.0g,蛋白胨lO.Og，牛肉膏lO.Og,葡萄糖5.0g，淀粉10.0g，乙酸钠3.0g，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，丁醇，pH6.8)与37"温箱中静置培养至对数期，作为发酵种子液。将上述获得的发酵种子液按照体积百分比为5%的量接种到装有3L玉米粉培养基(含有质量百分含量为7%的玉米粉和质量百分含量为0.3%的乙酸钠或丁酸钠的培养液)的7L发酵罐中进行发酵，发酵温度为37'C，发酵方式为静止发酵；发酵时间为48小时。将发酵后的发酵液用液相色谱检测各种有机溶剂含量，结果如表3所示。表3.添加不同外源物质时SB-1的溶剂产量(g丄-1)和丁醇比例<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>通过以上实例可以看出野生型丙酮丁醇梭菌(C/o^WwmacetoZm(y"CMm)SB-1CGMCCW2.2287在发酵过程中，具有较好的温度适应性，在35'C-39"C之间都可以较好的发酵，丁醇的比例一般在68%~72%之间。经过添加外源的的乙酸和丁酸后其丁醇的比例可以达到75%，且丁醇的产量超过了野生型菌株丁醇的耐受极限13克每升。这表明筛选到的菌株具有较好的遗传改造及应用前景。序列表〈160〉1<210〉1〈211>1411<212〉DNA<213〉丙酮丁醇梭菌(C/oWnW/wwaceto6M(y//ram)<400〉1tacacatgcaagtcg3gcggggaacttcggttcccagcggCgg3Cgggtg60gggtaacctacctcatagtggggaatagcctttcgaaaggaagattaataccgcataata120ctcgagaatcgcatgattctgatttattcgctatgagatggacccgcggc180gcattagcttgttggtgaggtaacggctcaccaaggcttcgatgcgtagccgeicctgaga240gggtgatcggccacattgga3ctga_ga_C3cggtccagactcctacgggaggcagcagtgg300ggaatattgcacaatgggggaaaccctgatgcagcaacgccgcgtgagtgstg犯ggtct360tcggatcgtaaaactctgtcttatgggacgataatgacggtaccst3ggaggaagccacg420gctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttact■gggcgtaaaggatgtgtaggcggatatttaagtgagatgtgaaatccccgggcttaactt540gggggctgcatttcaaactggatgtctggagtgcagg卿gga鄉c卿attcctagtg600tagcggtgaaatgcgt卿g3ttagg肌gaataccagtggcgaaggcggccttctggact660gtaactgacgctgaggcatgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtc720cacgccgtaactaggtgtaggaggtatcgactccttctgtgccgcagtta780aca_caa^3gtattccgcctgggaagtacggtcgceigigat￡igga^ttga_c840ggggacccgcacaagcagcggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttac■ctagacttgacatctcctgaattagtccgtgtcccttcggggetcaggatg960,ggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaac1020gagcgcaacccttatcattagttgctaacatttagttgagcactctagtgagactgcccg1080ggttaaccggg邓ggi鄉tggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgtctagggct1140acacacgtgctacaatggtgggg3caaaaagatgcaataccgcaaggtggagcaaaactc1200aaaaccccatcccagttcggattgtaggctgaaactcgcccggagttgct1260agtaatcgcg肌tcagaatgtcgcggtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccg1320tcacaccatg卿gtCggC3acacccgaagCCCgtg3ggtaaccttttggaaccagcggt1380cg肌ggtggggttgataattggggtg朋gtc141权利要求1、丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SB-1CGMCC№.2287。2、丙酮丁醇梭菌(C/oWWWwwaceo6w(y//cwm)SB誦1CGMCCW2,2287在发酵生产丁醇中的应用。3、根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述发酵生产丁醇的方法是将所述丙酮丁醇梭菌(C7o^r^Mmac"o6wy//cMm)SB-1CGMCC接种到发酵培养基中，于35-39。C，静止发酵得到丁醇溶液。4、根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵培养基为含淀粉的培养液；所述含淀粉的培养液优选为含玉米淀粉的培养液。5、根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述含玉米淀粉的培养液中的玉米淀粉的质量百分含量为8%。6、根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述发酵培养基中还含有质量百分含量为0.3%的乙酸钠或丁酸钠。7、根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述发酵的温度为37t:。8、根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述丙酮丁醇梭菌(C/o^7'&wmacetoZn^//cwm)SB-1CGMCC发酵初始浓度为109_10ucfu/mL。9、根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述接种是将生长至对数期的丙酮丁醇梭菌(C/o坩WwwflcetoZ>w(y//cwm)SB-1CGMCCW2.2287按照体积百分含量为5-10%的接种量接种到所述发酵培养基中。10、以丙酮丁醇梭菌(C/oWWAwmaceto6w0^cww)SB-1CGMCCW2.2287为活性成分的生物菌剂。全文摘要本发明公开了一株丙酮丁醇梭菌及其应用。该丙酮丁醇梭菌为丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SB-1CGMCC№.2287。利用本发明的丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)SB-1CGMCC№.2287用于发酵生产丁醇，发酵生产所得的溶剂中丁醇比例达68-75％。文档编号C12P7/16GK101250496SQ20081010267公开日2008年8月27日申请日期2008年3月25日优先权日2008年3月25日发明者张延平,寅李,王少华申请人:中国科学院微生物研究所