专利名称：新的抗β-淀粉样多肽抗体的可变区序列及其编码序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗P -淀粉样多肽的抗体，进一步涉及新的抗P -淀粉样
多肽的特异性scFv抗体，及其可变区的氨基酸序列和DNA编码序列。
背景技术：
阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)是一种以老年人中进行性记 忆障碍和智能衰退为主要临床特征的中枢神经系统退行性疾病。老年 斑、神经元纤维缠结和神经元丢失是AD的三大主要病理特征。其中 老年斑的主要成分是P-淀粉样多肽(beta-amyloid peptide, )聚集 形成的纤维，而A3被认为是导致神经元损伤及认知功能衰退的主要 致病物质[Frost D.Co-incorporation of A beta 40 and A beta42 to form mixed pre画fibrillar aggregates.Eur J Biochem,2003，270(4):654-663;i。 AJ3主 要包括A卩40和A卩42两种分子，由39 43个氨基酸组成。一般认为Ap 是由于编码APP的基因发生突变或其他原因导致p-分泌酶活性异常增 高时，与，分泌酶共同切割产生。现在也有观点认为AD患者脑内高 于正常人浓度的Ap可能是由于Ap的转运清除发生障碍所致。研究证 实大脑及脑脊液中AP含量的增高与认知能力下降密切相关。AP结构 中的疏水区域对于调节A(3纤维的形成起着重要的作用，其1 28位氨 基酸为亲水的氨基末端，29位之后为疏水的羧基末端。由于疏水氨基 酸主要位于羧基端，所以羧基端的长度决定其溶解性的高低，并影响 聚集成纤维的速度。AP相互聚集形成的纤维具有毒性，能够促发炎症 级联反应、轴突损伤、突触丢失和细胞凋亡等病理改变，是导致神经 元变性乃至形成痴呆的重要因素[McGeer EG ， McGeer PL ， Inflammatory processes in Alzheimer's disease[J] ， Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 2003， 27(5)1741-749]。
随着全世界人口老龄化程度的不断提高，这种疾病的发病率也在 逐渐的上升，给社会和家庭在物质和精神上都带来了巨大的影响。如何找到一种可以治疗这种疾病的药物是一个紧迫的需求。但至今尚无 特效的治疗措施，临床上主要以对症治疗和康复疗法为主，如应用乙 酰胆碱酯酶抑制剂，以弥补因神经细胞退化而带来的乙酰胆碱神经介
质下降。但这些疗法不能从根本上治疗AD。而针对AP多肽在发病中 的关键作用，研究开发抗Ap多肽抗体就具有治疗AD的实际应用价值。
抗AP抗体治疗AD，主要通过两种途径清除体内的AP [盛树力， 主编.老年性痴呆及相关疾病.北京科学技术文献出版社，2006:
179-200]。 一是抗体经过血脑屏障进入脑内与老年斑中的AP纤维结 合，小胶质细胞通过Fc受体与抗体的Fc片段结合，吞噬、清除其中 的AP纤维；二是抗体在外周循环中与可溶性的AP结合，增大血脑 屏障内外A3的浓度差，促进脑内的A0外流，从而降低脑内的A3 水平，减少Ae在脑内的聚集和沉积。目前，已证明抗AP抗体(包 括多抗、单抗、抗体片段等)在体外试验及动物体内对清除Ae有肯 定的效果，抗AP抗体治疗具有潜在的应用价值。
体外试验研究进展主要是观察抗A3抗体中和或清除AP的作用。 Legleiter等分别用m266和3D6单克隆抗体与AP l-42以l: IO的摩尔比一 起孵育，几天之后用原子力显微镜(AFM)观察AP纤维形成情况发现 两种单抗都能有效抑制AP纤维的形成，其中m266效果更好一些 [Legleiter J，Czilli DL,Gitter B,et al.Effect of different anti-Abeta antibodies on Abeta fibrillogenesis as assessed by atomic force microscopy.J Mol Biol，2004,335(4):997-1006]。抗A3抗体可以提高细胞对AP的耐受性、 对培养的PC12细胞及海马神经元具有保护作用[杨志勇,汪华侨，徐杰等. 阿尔茨海默病人外周血中抗淀粉样蛋白的特性.解剖学研 究，2005,27:83-87.Du Y,Wei X，Dodel R，et al.Human anti-P-amyloid antibodies block P -amyloid fibril formation and prevent P -amyloid-induced neurotoxicity.Brain,2003,126(9):1935-9]。为了检测抗体 清除斑块的效应,Bard等用抗A3单抗(10D5、 3D6)经腹腔注射给PDAPP
转基因小鼠，六个月后处死小鼠，其冰冻脑切片与小胶质细胞一起孵 育24小时，通过免疫染色发现外源小胶质细胞可以吞噬斑块中的AP纤 维；而对照组，斑块保持完整且未见小胶质细胞的吞噬现象[Bard F,Cannon C,Barbour R，et al.Peripherally administered antibodies againstamyloid beta-peptide enter the central nervous system and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease.Nat Med,2000，6(8):916-9]。有文献报道健康人体内提取的静注免疫球蛋白 (IVIQ intravenous immunoglobulin)中含有抗A 抗体[Dodel RC，Du Y,Depboylu C,et al.Intravenous immunoglobulins containing antibodies against fi-amyloid for the treatment of Alzheimer's disease.Joumal of Neurology Neurosurgery and Psychiatry,2004,75:1472-1474]，这些抗体不 仅能抑制AP聚集成纤维，还能使已经形成的A3纤维降解，同时还可 以提高小胶质细胞向淀粉样斑块迁移的能力，并介导小胶质细胞吞噬、 降角军A P [Solomon B.Intravenous immunoglobulin and Alzheimer's disease immunotherapy. Curr Opin Mol Ther，2007,9(1 ):79-85. Istrin G，Bosis E，Solomon B,et al.Intravenous immunoglobulin enhances the clearance of fibrillar amyloid-beta p印tide.J Ne蘭sci Res，2006，84(2):434-43] 。 Fukuchi 等提出，抗AP抗体的scFv片段也可以抑制Ae寡聚体(AP oligomers) 对HEK293细胞的毒性作用[Fukuchi K,Accavitti-Loper MA,Kim HD，et al.Amelioration of amyloid load by anti-Abeta single-chain antibody in Alzheimer mouse model.Biochem Biophys Res Commun ， 2006 ， 344(1):79-86]。上述体外试验表明，抗A3抗体可以通过Fc受体介导小 胶质细胞吞噬、降解Ae纤维，也可以通过其他方式来抑制A3聚集成 纤维或斑块。
动物试验是抗体进入临床研究的前提,目前大多数实验动物采用 APP转基因鼠。抗体经外周(如静脉、腹腔)或经颅腔导入动物体内， 然后观察抗体在体内的分布、发挥作用的部位及作用效果。1999年 Schenk等发现抗AP抗体可以清除小鼠脑内老年斑并可预防老年斑的 形成[Schenk D,Barbour R，Dunn W，et al.Immunization with amyloid—beta attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse. Nature, 1999， 400(8):173-7]。 DeMattos等将抗A P单克隆抗体m266经外周静脉 注入仅能在脑组织中表达APP的PDAPP转基因小鼠体内，结果显示血 浆中Ae浓度增高1000倍，脑组织中AP蓄积明显减少，说明抗体能中 和外周循环中的AP ，使脑内的Ae逐歩扩散入血液而被清除[DeMattos RB，Bales KR，C画mins DJ,et al.Peripheral anti-A beta antibody alters CNS and plasma A beta clearance and decreases brain A beta burden in a mousemodel of Alzheimer's disease.Proc Natl Acad Sci U S A， 2001， 98 (15):8850-5]。 Bard等将抗A 3抗体经腹腔注射到PDAPP转基因小鼠体 内，六个月后影像学发现脑内斑块减少80%以上，抗体能通过血脑屏障 结合淀粉样斑块，并激活小胶质细胞，促进了先前已存在的淀粉样斑 块的清除。Chauhan等直接将抗体注射到第三脑室中，并且在注射后不 同时间段检查小鼠的大脑组织，检测结果表明，到第四周时，治疗组 淀粉样蛋白的密度比对照组小鼠减少了67%，同时也证明了抗A3单抗 脑室内注射后第四周效果达到高峰，八周后开始消失[Chauhan NB,Siegel GJ.Intracerebroventricular passive immunization in transgenic mouse models of Alzheimer's disease.Expert Rev Vaccines, 2004, 3(6):717-25. Chauhan NB.Intracerebroventricular passive immunization with anti-oligoAbeta antibody in TgCRND8.J Neurosci Res， 2007， 85(2):451-63]。近来发现脑内AP寡聚体也有较强的毒性，Ma等将抗A P抗体注射到Tg2576转基因小鼠脑内，发现其可以清除小鼠脑内Ae寡 聚体，对保护动物脑神经损伤有积极意义[Ma QL,Lim GP,Harris-White ME，et al.Antibodies against beta-amyloid reduce Abeta oligomers,glycogen synthase kinase-3beta activation and tau phosphorylation in vivo and in vitro， J Neurosci Res， 2006， 83(3):374-84]。 Levites等发现，抗AP1画40 及A3 l-42的单克隆抗体注入APP转基因小鼠体内后，脑内淀粉样斑块 总量减少50。/。左右[Levites Y,Smithson LA,Price RW,et al.Insights into the mechanisms of action of anti-Abeta antibodies in Alzheimer's disease mouse models.FASEB J，2006,20(14):2576-8. Levites Y，Das P,Price RW，et al.Anti-Abeta42- and anti-Abeta40-specific mAbs attenuate amyloid deposition in an Alzheimer disease mouse model.J Clin Invest, 2006， 116(1):193-201]。除了上述全抗体以外，抗体片段也能在动物体内发挥 效应。研究人员已经成功应用抗AP单克隆抗体片段，如特异F(ab' )2 片段、scFv片段等，经腹腔注射、颅内注射或经腺病毒介导等不同给 药途径导入APP转基因小鼠体内，都明显减少了脑内的老年斑块 [Tam歸 Y,Hamajima K，Matsui K,et al.The F(ab)'2 fragment of an Abeta-specific monoclonal antibody reduces Abeta deposits in the brain.Neurobiol Dis，2005，20(2):541-9. Fukuchi K,Tahara K，Kim
HD,et al.Anti-Abeta single-chain antibody delivery via adeno-associatedvirus for treatment of Alzheimer's disease.Neurobiol Dis ， 2006 ， 23(3):502-ll]。
抗AP抗体治疗AD在体外试验和动物试验中是比较成功的。但 最终要用于人体治疗的抗体必须是经过人源化的，以克服鼠单克隆抗 体在人体引起人抗鼠抗体(HAMA)反应的局限性。获得人源化抗体 一般是采用将鼠源抗体进行人源化改造，但这种方法技术复杂难度高， 即使改造后也难以得到百分之百的人源化，且有可能在改造过程中使 原来抗体的效价亲和力降低[Mike Clark. Antibody humanization: a case of the 'Emperor ，s new clothes Immunol Today, 2000, 21(8): 397-402]。 另一方法就是利用噬菌体表面展示技术直接从人源抗体基因库中筛选 [Hennie RH. Selecting and screening recombinant antibody bibraries. Nature Biotechnol， 2005， 23(9): 1105-1116]，天然抗体库中的基因来自 于未经免疫的人B细胞(外周血淋巴细胞或脾细胞)全套可变区基因， 具有足够的容量和广泛的多样性，通常含有106-109个不同抗原结合特 异性的抗体分子克隆，可以对百万乃至亿万个分子进行选择，且每一 轮"吸附一洗脱一扩增"可以使目的抗体浓度浓縮50-1000倍，使抗原 特异性较强的克隆得到富集，非常容易从抗体库中筛选到特异性抗体。 而且从中筛选出来的抗体已经是完全人源的，无需再进行人源化改造。 单链抗体(scFv)是利用噬菌体表面展示技术制备的小分子抗体片段， 它没有完整抗体的Fc段，只包含VH和VL片段以及中间的连接肤 (Linker),却较好地保持了完整抗体的抗原亲和活性，是具有完整抗原 结合位点的最小抗体片段。
scFv与完整的抗体相比，具有如下优点:(l) scFv分子小、免疫原
性低。其相对分子量只有完整抗体的六分之一，应用于人体不易产生 异源反应。(2)scFv穿透力强。进入机体后，能够迅速穿过血管壁和组 织屏障到达耙细胞和靶组织，有利于疾病治疗。(3)scFv可在原核系统 中表达，易于基因操作和基因工程大量生产，成本低廉；也可用基因 工程方法构建与其他效应分子如药物、细胞因子等连接的各种融合蛋 白。(4) scFv没有Fc段，不需要与非靶细胞的Fc受体结合，有利于 作为导向药物的载体。(5)scFv半衰期短，易从血液清除，肾脏蓄积量 少，鉴于scFv具备的以上优点，使其己经得到了较为广泛的应用。目前，scFv的研究和利用基因工程生产及应用进展迅猛，在生物制剂药
的临床试验中已占据30%以上的份额。但scFv半衰期短也是它的一个 缺点，scFv的另一缺点是稳定性较差易于降解。
全抗体是将可变区基因连接上人抗体的恒定区FC段基因重组而 成，全抗体因为有恒定区和FC段，分子量更大、稳定性更高和半衰期 更长；由于全抗体是双价结合抗原，而scFv是单价结合抗原，所以理 论上亲和力会比scFv大；再者，全抗体的恒定区和FC段可以相应激 活补体，有利于直接清除抗原，或与具有FC受体的细胞结合而产生免 疫清除作用，所以理论上更具有应用价值。但是全抗体会增加穿过血 脑屏障的难度，但已有研究显示确有部分抗体可以穿过血脑屏障发挥 作用，而即使留在血循环中的抗体也可与血液中的AP结合并清除， 血液中的AP降低后大脑中的A3单体会不断渗透到血管中，从而使 大脑中的A3物质得以减少，同样起到减少大脑中A3病变物质的作 用[DeMattos RB, Bales KR， Cummins DJ， et al. Peripheral anti-Ap antibody alters CNS and plasma Ap clearance and decreases brain A|3 burden in a mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci USA, 2001,98(15): 8850—8855]。
发明内容
鉴于目前治疗AD的状况，发现新的抗AP抗体有助于促进和改 善对治疗AD的治疗。本发明提供新的人源化抗AP抗体可变区片段 及其编码序列。
本发明提供了一种包括重链可变区、轻链可变区和连接序列的人 源抗A 0特异性scFv抗体，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2 所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。
本发明还提供了一种编码所述的人源抗AP特异性scFv抗体的 DNA，其核苷酸序列由SEQIDNO:l所示的DNA、 SEQIDNO:3所示 的DNA和编码连接序列的DNA组成。
另一方面，本发明还提供了编码抗A P特异性scFv抗体的重链可 变区序列的DNA，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示；编码抗AP特 异性scFv抗体的轻链可变区序列的DNA，其核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。
再一方面，本发明提供了包括所述的DNA的重组载体及其相应的 重组宿主细胞。重组宿主细胞优选的是大肠杆菌rEw/^7'c/2^co//)。
进一步，本发明提供了于2008年3月12日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.2399的重组
大肠杆菌。
本申请提供的有益效果在于提供了一种新的抗A0抗体，且所获 得的抗AP抗体是scFv。
图l:阳性噬菌体克隆的ELISA检测结果。
图2:阳性噬菌粒PCR结果，其中M为标记物；l-7为ELISA效 价较高的7个噬菌体克隆。
图3:阳性克隆可溶性表达全菌蛋白电泳结果，其中M为标记物；
2、 4、 6、 8、 9、 11、 13为诱导的AIO、 D8、 F2、 B9、 E6、 F4、 G2 噬笛体克隆；1、 3、 5、 7、-10、 12、 14为相应的噬箇体克隆但未经IPTG 诱导。
图4: A10克隆可溶性表达的scFv抗体在各组分中的分布，其中1 为未诱导的培养上清；2为IPTG诱导的培养上清；3为未诱导的胞周 质；4为IPTG诱导的胞周质；5为未诱导的全菌蛋白；6为IPTG诱导 的全菌蛋白。
图5:诱导株与未诱导株各组分中可溶性scFv的ELISA结果。 图6:抗AP抗体抗体的基因可变区序列及相应的蛋白质序列。
本领域技术人员可以明白，根据本申请公开的内容结合本领域技 术常识，本申请公开的DNA序列和氨基酸序列可以按照本领域常用的 其他方法合成，例如通过化学合成的方法得到本申请公开的序列。而 且，本领域技术人员可以将本申请获得的新的DNA序列构建到任何合 适的载体、宿主细胞中。下述内容仅仅是对本申请要求保护的范围的 示例性说明，本领域技术人员可以根据所公开的内容对本申请的发明 作出多种改变和修饰，而其也应当属于本申请要求保护的范围之中。
具体实施例方式
实施例l:单克隆噬菌体抗体的筛选
利用噬菌体展示技术对人源噬菌体单链抗体库进行多轮富集筛 选，以纯化的阿尔茨海默病A3为抗原进行了四轮"吸附一洗脱一扩 增"的富集筛选，显示每轮筛选回收率呈递增趋势，说明经过筛选后， 具有AP特异性的噬菌体得到了高度富集(表l)。方法如下
(1) 噬菌体抗体库的扩增取100)il原库菌液，接种到100ml 2 X YT-AG(含100吗/ ml氨苄青霉素，1%葡萄糖的2X YT)培养基中， 37°C振荡培养至对数期。加1012pfo (噬菌斑形成单位)辅助噬菌体 M13K07于培养液，37°C水浴30min， 4°C离心后弃上清。用100ml2 X YT-AK(含lOOpg / ml氨苄青霉素，50pg / ml卡那霉素的2X YT)重 悬沉淀，37°C培养过夜。4。C离心，上清即为扩增后的噬菌体抗体库。 加100mlPEG/NaCl于上清中，冰浴lh后离心弃上清，用PBS重悬 沉淀，4'C保存。
(2) 抗体库的富集筛选以纯化的A3 1-42 (400ng /孔)包被酶标 板8个孔，4。C放置过夜。次日用2。/。MPBS(含2。/。脱脂奶粉的PBS)37 'C封闭2h，弃上清，洗孔后，每孔加入100pl扩增后的噬菌体抗体上 清，37。C孵育2h。弃上清，洗孔(第一轮筛选时洗3次，第二轮洗5 次，第三轮以后洗10次以上)，每孔加100pl 100mmol/L甘氨酸-盐酸
(pH2.2)洗脱特异性噬菌体抗体，室温孵育10min后，立即加入lmol/L Tris(pH7.4)中和特异洗脱下来的噬菌体抗体。将洗脱液加入2ml新鲜制 备的对数期TG1菌液中，37°C水浴30min后，取少量菌液测噬菌体 抗体滴度，余全部涂TYE—AG平板，37°C培养过夜，次日从TYE 板上刮下菌落，所得到的菌落被扩增并用于制备下一轮筛选用噬菌体。 共进行四轮筛选。计算每轮投入和产出量。
表l各轮富集筛选中噬菌体抗体的回收率
筛选次数投入量(pfli)产出量(pfii)回收率(％)
13.68X101'1.28X1063.31 X10-4
21.02X10111.62 X1061.59X10-3
103 1.98X 1011 4.32X107 2.18X 10—2
4 3.20X10'1 2.45 X108 7.65 X 10—2
注回收率(％)=产出噬菌体量/投入噬菌体景X 100% 实施例2:对单克隆噬菌体抗体进行检测
从第四轮筛选后过夜培养的TYE-AG平板上随机挑取80个单细菌 克隆，培养制备噬菌体抗体。检测用ELISA法抗原A3包被酶标板 (0.4pg/ L)，封闭后向每孔加lOOpl单克隆噬菌体抗体上清液，37。C温 育2h。洗涤后加入1:5000的HRP标记鼠抗M13抗体，37"C温育lh。 阳性对照为一抗(鼠抗人A3)， 二抗(羊抗鼠lgG);阴性对照仅加入2% MPBS。以OPD为底物，2M硫酸终止反应，经酶标仪OD490nm检测。 以OD值大于阴性对照的2倍，判断为阳性。单克隆噬菌体抗体与A P抗原结合的检测结果经ELISA检测，共得到7个阳性克隆(AIO、 D8、 F2、 B9、 E6、 F4、 G2)。 7个阳性克隆ELISA结果的A值均高于 阴性对照2倍以上。取其中ELISA效价较高的2个克隆A10和F2反 复鉴定。结果显示，这2个克隆均可特异性识别A3纯化抗原，不与 阴性对照无关抗原结合，且ELISA检测A值高于阴性对照5倍以上(图 1)。
(2) PCR鉴定阳性克隆菌液PCR扩增第四轮筛选后获得的阳 性克隆菌，引物为通用引物LMB3和Fdseq。引物扩增产物经1%琼脂 糖凝胶电泳分析。结果7个阳性菌经质粒提取后行PCR扩增，经凝 胶电泳，可见7个克隆片段为1050bp左右，符合预期scFv抗体片段 PCR产物的理论值(图2)。
实施例3:可溶性抗AP scFv片段的表达和鉴定 (1)阳性噬菌粒在大肠杆菌HB2151中诱导表达，将展示有特异 结合AP的抗体的噬菌体感染对数期大肠杆菌HB2151， 37t:水浴静置 30min 。接种于SOBAG-N平板上，3(TC培养至长出单菌落。从多个 不同克隆来源的平板上各挑l个克隆，分别接种于5ml2XYT-AG培 养基中，30。C振摇过夜。将5 ml过夜菌加到50 ml新鲜2X YT-AG培 养基中，于30 。C振摇l h。离心，弃上清，沉淀重悬于50 ml新鲜2XYT-AI(I:IPTQlmM)培养基中，30 。C诱导表达20h。离心，上清 过滤除菌-20'C储存。将一管沉淀用0.5ml冰冷的1 XTES重悬，然后加 入0.75ml冰冷的1/5XTES进行涡旋，冰浴30 min。离心，上清即周 质提取物，-2(TC储存。将另一管沉淀用0.5mlPBS悬浮，煮沸5min， 离心，上清即全菌提取物，-20"储存。取各克隆的全菌蛋白进行 12%SDS-PAGE电泳，可见A10和F2克隆在相对分子质量约33,000Da 处呈现目的条带，这一条带与预计的可溶性scFv的分子量相符，其他 5个克隆未见相应位置的目的条带(图3)。
(2) Western Blot:将表达产物样品处理后经12%SDS-PAGE电 泳分离后，于冰浴、170mA下进行电转，然后将硝酸纤维素膜浸入TBS
(含5%脱脂奶粉)中，4。C封闭过夜。再与1:2000的HRP标记鼠抗 c-myc标签抗体37°。温育2h。洗涤后加入1:5000的HRP标记羊抗鼠 IgG抗体37。C温育1 h。 DAB显色，以未经IPTG诱导的相应产物作对 照。检测可溶性抗AP scFv的表达。将A10克隆诱导表达后的菌液上 清、胞周质提取物和全菌蛋白进行Western Blot检测，可见在相对分子 质量约33，000Da处呈现阳性条带，以全菌蛋白反应更强，这一条带与 预计的可溶性scFv的分子量相符，而未诱导的A10克隆未检测到阳性 条带(图4)。
(3) ELISA检测表达产物抗体活性步骤同单克隆噬菌体抗体的 ELISA检测。 一抗为表达产物可溶性抗体，二抗为1:2000的HRP标记 鼠抗c-myc标签抗体，三抗用1:5000的HRP标记羊抗鼠IgG抗体， 阴性对照仅加入2% MPBS。效价较高的A10和F2克隆的各组分表达 抗体ELISA结果显示，抗体可与人AP结合，不与阴性对照无关抗原 结合，诱导株的A值高于未诱导株的2倍以上，其中在上清中和全菌 蛋白中分别高于5倍以上(图5)，表明抗体具有生物学活性。因此， 初步认定A10和F2克隆菌分泌的产物即为抗人A P特异性scFv抗体。
实施例4:DNA序列测定
提取阳性克隆的噬菌粒，利用ScFv DNA测序引物，交由上海生 工测序部经双脱氧末端终止法对scFv DNA中的VH和VL DNA分别 进行序列测定。人源抗A 3特异性scFv抗体基因的序列分析获得A10和F2克隆的轻链、重链可变区的核苷酸序列，并运用Blast软件对所 获得的序列与GeneBank中的免疫球蛋白可变区基因进行综合比对分 析。分析结果表明所获得的A10和F2克隆的可变区基因符合scFv 抗体基因，推导得到的氨基酸序列具有典型的抗体可变区结构，蛋白 序列根据Ig blast和Kabat编码确定出CDR的起始和终止部位。下划 线部分为高变区(HVR)，又叫互补决定区(CDR)，其氨基酸组成和 排列顺序高度可变。VH和VL的3个CDR共同组成免疫球蛋白的抗 原结合部位，负责识别及结合抗原，从而发挥免疫效应。其余部分为 骨架区(FR)，其氨基酸组成和排列顺序相对不易变化。(图6)， 2个 克隆的基因序列一致，表明2个克隆菌可能来源于同一株原始噬菌粒。 其中将抗AP抗体基因的重链可变区序列命名为SEQ IDNO.:l,其 编码的蛋白质序列命名为SEQ IDNO.:2;将抗AP抗体基因的轻链可 变区序列命名为SEQ ID NO.:3,其编码的蛋白质序列命名为SEQ ID NO.:4。其中，重链可变区的CDR1的序列为SEQIDNO.:5， CDR2的 序列为SEQ ID NO.:6， CDR3的序列为SEQ ID NO.:7;轻链可变区的 CDR1的序列为SEQIDNO.:8， CDR2的序列为SEQ ID NO.:9， CDR3 的序列为SEQ IDNO.:IO。
实施例5:工程菌株的长期保存。
1)含阳性噬菌粒的TG1菌株利用噬菌体展示技术筛选出的阳
性噬菌体感染TG1菌得来。复苏后可在2XYT-AG(A: Amp, 100吗/ ml; G: ly。Glu)中与噬菌体融合表达出抗A e的scFv抗体。
2)含阳性噬菌粒的HB2151菌株利用噬菌体展示技术筛选出的 阳性噬菌体感染HB2151菌得来。复苏后可在2XYT-AI(A:Amp, lOOjig /ml; I : IPTQ1 mM)中可溶性表达出抗AP的scFv抗体，该菌株于 2008年3月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，保藏号为CGMCCNo.2399。序列表
<110>中国医学科学院基础研究所
〈i2o>新的抗e -淀粉样多肽抗体的可变区序列及其编码序列
<160> 10
<170〉 Patentln version 3.4
<210> 1
〈211〉 369
<212> 腿
<213> 人
<400> 1
g鄉tgcagctggtgcagtctggggctgaggtga卿ggcctgggtcgtcggtg朋cgtc60
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ggggtaggagtggcaacaacatattggctcgacccctggggccaggggaccacggtcacc360
gtctcctcc369
〈400〉 2
Glu Val Gln 1
Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ser
5
10 15
Ser Val Asn Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Leu Ser Asn Tyr
20 25
30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Gly lie lie Pro Ser Phe Gly Pro Ala Asn Tyr Ala Gin lie Phe 50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65
70
75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85
90 95
Ala Arg Glu Gly Gly Val Gly Val Ala Thr Thr Tyr T卬Leu Asp Pro 100 105 110
s人
14Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<400> 4
His Phe Met Leu Thr Gin Pro His Ser Val Ser Glu Ser Pro Gly Lys 15 10 15
Thr Val Thr lie Ser Cys Thr Arg Ser Ser Gly Ser lie Ala Ser Thr 20 25 30
Tyr Val His Trp Tyr Gin Gin Arg Pro Gly Thr Ser Pro Thr Thr Val 35 40 45
lie Tyr Glu Asp Asn Arg Arg His Ser Arg Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60
Gly Ser lie Asp Ser Ser Ser Asn Ser Ala Ser Leu Thr lie Ser Gly 65 70 75 80
Leu Lys Thr Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Gin Ser Tyr Asp Ser 85 90 95
Thr Asn Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 100 105 110
<400〉 3 cattttatgctgactcagccccactctgtgtcggagtctccgggg肌gacggtaaccatc60
tcctgcacccgcagcagtggcagcattgccagcacctEitgtgcactggtaccagcagcgc120
ccgggcticttCCCCC3CC3Ctgtgatctatgaggataaccg犯gacactctagagtccct180
gatcgcttctctggctccatcgacagctcctccaactctgcctccctcaccatctctgga240
ctgaageictg鄉acgagggtgactactactgtcagtcttatgatagcacc犯tgcgtgg300
gtgttcggcgg鄉gacc犯ggtcaccgtcctaggt336
<400〉 5
Asn Tyr Gly Leu Ser 1 5
<210> <211> <212> <213>
6 A
3 N 、
3 3 D 7
> z\ z\ >
2 2 2 2
V < < <
XPro Ser Phe Gly Pro Ala Asn Tyr Ala Gin lie Phe Gin 5 10 15
Val Gly Val Ala Thr Thr Tyr Trp Leu Asp Pro Trp Gly 5 10 15
Ser Gly Ser lie Ala Ser Thr Tyr Val His 5 10
Arg Arg His Ser 5
Asp Ser Thr Asn Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly 5 10
〈210〉 6
<211> 17
<212> PRT
<213> 人
<400> 6
Gly lie lie
Gly
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> 人
<400> 7
Glu Gly Gly 1
Gin Gly
<400〉 8
Thr Arg Ser 1
<210> 9
<211> 7
<212〉 PRT
〈213〉 人
<400> 9
Glu Asp Asn 1
<210> 10
<21D 14
<212〉 PRT
<213> 人
<400〉 10
Gin Ser Tyr 1
3 R、
i
权利要求
1.一种包括重链可变区、轻链可变区和连接序列的人源抗Aβ特异性scFv抗体，其特征在于其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。
2. —种编码如权利要求1所述的抗AP特异性scFv抗体的重链可 变区序列的DNA，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示。
3. —种编码如权利要求1所述的抗A P特异性scFv抗体的轻链可 变区序列的DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4. 一种编码如权利要求1所述的人源抗AP特异性scFv抗体的 DNA，其核苷酸序列由权利要求2所述的DNA、权利要求3所述的 DNA和编码连接序列的DNA组成。
5. —种包括如权利要求4所述的DNA的重组载体。
6. —种包括如权利要求5所述的重组载体的重组宿主细胞。
7. 根据权利要求6所述的重组宿主细胞，其是大肠杆菌rS"/^7'W/"
8. 根据权利要求7所述的重组宿主细胞，所述的大肠杆菌于2008 年3月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏号为CGMCC No.2399。
全文摘要
本发明涉及新的抗β-淀粉样多肽抗体的可变区序列及其编码序列。本发明利用噬菌体展示技术对人源噬菌体单链抗体库进行多轮筛选富集具有Aβ特异性的噬菌体，通过对其培养制备噬菌体抗体，并且鉴定获得阳性克隆。然后在大肠杆菌中表达获得可溶性的抗Aβ scFv片段，通过测序获得其相应的编码序列。因此，本发明提供了新的抗Aβ scFv片段及其编码序列。
文档编号C12N15/63GK101538329SQ20081010229
公开日2009年9月23日 申请日期2008年3月20日 优先权日2008年3月20日
发明者平 梁 申请人:中国医学科学院基础医学研究所